王騰斌，李寶坤，盧士玲，王慶玲，董娟

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種四碳的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于微生物、植物、脊椎動(dòng)物以及昆蟲(chóng)中。在植物和細(xì)菌中，它在三羧酸循環(huán)中起到關(guān)鍵的代謝作用，在脊椎動(dòng)物大腦中起到神經(jīng)信號(hào)傳遞的作用[1]。GABA具有突出的生理功能，例如：降血壓、治療肝損傷、治療抑郁和癲癇等神經(jīng)性疾病、預(yù)防糖尿病等[2-5]。

現(xiàn)今GABA合成的方法主要有4種：化學(xué)合成法、植物富集法、酶合成法與微生物合成法。對(duì)這4種方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)：化學(xué)合成法制備的GABA無(wú)法運(yùn)用于食品工業(yè)與飼料中；植物富集法通過(guò)富集后，GABA含量仍然較低；酶合成法由于多以固定化酶的方式生產(chǎn)，成本相對(duì)過(guò)高；而微生物合成法則具有成本低、含量高、可用于食品等特點(diǎn)[6]，因此高產(chǎn)GABA菌株的篩選也變得更加重要。

新疆擁有豐富的乳品資源與千古流傳的傳統(tǒng)制作工藝，各民族憑借這種優(yōu)勢(shì)，制作出各種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。由于在制作過(guò)程中，經(jīng)天然的乳酸菌與酵母菌參與，使得這些傳統(tǒng)乳制品中具有豐富的微生物資源，這為功能性乳酸菌、酵母菌的篩選提供了寶貴的微生物資源[7]。并且乳酸菌一般被視為GRAS級(jí)微生物，其能生產(chǎn)食品級(jí)GABA已被普遍共識(shí)。因此，本研究旨在從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品奶酪、酥油、酸奶中篩選出GABA合成量較高的乳酸菌，并對(duì)其益生特性進(jìn)行初步分析，為今后富含GABA食品的研發(fā)提供優(yōu)良的乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：新疆傳統(tǒng)奶酪、酥油、酸奶，分別采自新疆阿勒泰市和伊寧縣的不同牧民家庭和市場(chǎng)。

試劑：乙腈、三乙胺、苯異硫氰酸酯、γ-氨基丁酸均為色譜級(jí)，美國(guó)Sigma公司；谷氨酸鈉、DPPH、鄰菲羅啉、過(guò)氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、正丁醇、冰乙酸、硫代乙醇酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；薄層色譜硅膠，上海盛亞化工有限公司；PCRMix試劑，天根生化科技有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MSG-MRS培養(yǎng)基：向MRS液體培養(yǎng)基中加入1%谷氨酸鈉，pH調(diào)至6.5。

MRS-THIO培養(yǎng)基：向MRS液體培養(yǎng)基中加入0.2%硫代乙醇酸鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

指示菌株：表皮葡萄球菌CICC10294、大腸桿菌CICC10662、金黃色葡萄球菌CICC10348、腸炎沙門氏菌CICC21482，由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏。

1.4 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；5417R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 蘇州江東精密儀器有限公司；梯度PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；BenchTop Pro冷凍干燥機(jī) 美國(guó)VirTis公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.5 乳酸菌的篩選

1.5.1 菌株的分離純化

參考Xiong等[8]的方法，利用梯度稀釋涂布法與平板劃線法對(duì)新疆傳統(tǒng)奶酪、酥油、酸奶中的菌株進(jìn)行分離與純化，將分離的菌株于-80 ℃甘油管保藏。

1.5.2 16S rDNA分子學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行分離菌株DNA的提取。PCR擴(kuò)增引物：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；PCR擴(kuò)增體系：12.5 μL PCRMix、9.5 μL ddH2O、27f與1492r引物各1 μL、模板DNA 1 μL；PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，若在1450 bp處有單一條帶且無(wú)非特異性條帶存在，則送至上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA 7建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選

1.6.1 菌株的準(zhǔn)備

取-80 ℃保藏的乳酸菌甘油管，按4%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，沾取菌液劃線純化，挑取單菌落于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)活化2次，最后一次培養(yǎng)至OD600=1備用。

1.6.2 薄層色譜法定性

參考Kwon等[9]的方法，稍作修改：將1.6.1中菌液按4%接種于5 mL MSG-MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，10000 r/min離心10 min，獲得上清液。各取1 μL 1 mg/mL MSG標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 mg/mL與2 mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，菌株上清液點(diǎn)樣于薄層色譜硅膠板上，在含有0.4 g茚三酮的正丁醇∶冰醋酸∶蒸餾水為3∶1∶1的100 mL展開(kāi)劑中層析90 min，105 ℃顯色15 min。

1.6.3 Berthelot法初步定量

將1.6.2中方法獲得的上清液按照梁慧等[10]的方法進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稍作修改：取0.1 mg/mL(0.9 mg/mL MSG)、0.2 mg/mL(0.8 mg/mL MSG)、0.4 mg/mL(0.6 mg/mL MSG)、0.6 mg/mL(0.4 mg/mL MSG)、0.8 mg/mL(0.2 mg/mL MSG)、1 mg/mL(0 mg/mL MSG)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 HPLC精確定量

參考Kantachote等[11]的方法，部分優(yōu)化。

柱前衍生：按照1.6.2中方法獲得上清液，取1 mL GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液或適當(dāng)稀釋的上清液冷凍干燥，將殘余物中加入1 mL乙醇-水-三乙胺(4∶4∶2)溶液和80 μL乙醇-水-三乙胺-苯異硫氰酸酯(6∶1∶1∶1)，在室溫下避光反應(yīng)20 min，形成PITC-GABA，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，上樣分析。

色譜條件：色譜柱：Shimazu C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相A：1.4 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液，并加入0.1%三乙胺和6%乙腈， pH調(diào)至6.1，流動(dòng)相B：60%乙腈；洗脫程序：0%～100%流動(dòng)相B；梯度洗脫50 min；0%流動(dòng)相B，保持10 min，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。選取0.01，0.1，0.25，0.4，0.5 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 耐酸能力分析與膽鹽耐受性評(píng)價(jià)

1.7.1 耐酸能力評(píng)價(jià)與添加谷氨酸鈉的影響

參考Leite等[12]的方法，稍作修改：將1.6.1中菌液在12000 r/min下離心10 min，去除上清液，并重懸于0.02 mol/L pH 6.5的PBS緩沖液中，稀釋至OD600=0.6，并以10倍稀釋接種于pH 2.5，3.0，4的MRS-THIO液體培養(yǎng)基中，以pH 6.5作為對(duì)照，在37 ℃培養(yǎng)0，1，2，3，4 h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。存活率(%)=[人工胃液/腸液處理后活菌數(shù)(log CFU/mL)]/最初活菌數(shù)(log CFU/mL)。

基于對(duì)食品安全與風(fēng)味考慮，食品中谷氨酸鈉推薦添加量為0.1%～0.8%[13]，因此向MRS-THIO液體培養(yǎng)基中加入0.5%谷氨酸鈉，其他操作相同，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定谷氨酸鈉對(duì)菌株耐酸能力的影響。

1.7.2 膽鹽耐受性評(píng)價(jià)

參考Delgado等[14]的方法，稍作修改：將1.6.1中菌液按照4%接種量接入含有0.15%、0.3%、0.4%牛膽鹽的MRS-THIO液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)，以不添加牛膽鹽MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)至OD620上升0.3個(gè)單位。對(duì)比添加牛膽鹽組與對(duì)照組，觀察生長(zhǎng)情況與滯后時(shí)間。

1.8 益生特性評(píng)價(jià)

1.8.1 胃腸道模擬與添加谷氨酸鈉的影響

參考Guo等[15]的方法進(jìn)行人工胃液與腸液的配制。食物在胃里的停留時(shí)間一般為3～4 h，流體食物一般為1～3 h。人體胃中pH由于飲食結(jié)構(gòu)的不同波動(dòng)較大，一般在pH 3.0左右，而腸道內(nèi)pH值約為8.0，食物在腸道內(nèi)停留的時(shí)間一般為2～6 h[16]，因此本文選擇在pH 3的人工胃液中處理3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，之后連續(xù)接種于pH 8的人工腸液中處理6 h進(jìn)行計(jì)數(shù)。另外，向人工胃液中加入0.5%谷氨酸鈉，其他操作相同，確定谷氨酸鈉對(duì)胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)的影響。存活率計(jì)算同1.7.1。

1.8.2 抗氧化能力

1.8.2.1 完整細(xì)胞組與無(wú)細(xì)胞提取物的制備

按照1.6.1中方法獲得菌液，8000 r/min離心15 min，去除培養(yǎng)基，用0.02 mol/L pH 7.2的PBS緩沖溶液洗去培養(yǎng)基，重復(fù)3次，最后重懸于PBS緩沖溶液，使OD600=1。一組作為完整細(xì)胞組進(jìn)行測(cè)定，另一組進(jìn)行超聲波破碎(總功率750 W，破碎效率75%，溫度4 ℃，破碎時(shí)間5 min，破碎6 s間歇3 s)，破碎后10000 r/min離心15 min，取上清液于離心管中，在顯微鏡下鏡檢，至無(wú)完整細(xì)胞后立刻進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.8.2.2 DPPH自由基清除能力

參考He等[17]的方法進(jìn)行DPPH清除率實(shí)驗(yàn)與計(jì)算。

1.8.2.3 羥自由基清除能力

參考Zhang等[18]的方法進(jìn)行羥自由基清除率實(shí)驗(yàn)與計(jì)算。

1.8.2.4 還原能力測(cè)定

參考楊靜秋[19]的方法進(jìn)行乳酸菌還原能力實(shí)驗(yàn)與計(jì)算。

1.8.3 抑菌能力

參考楊靖鵬等[20]的方法，以表皮葡萄球菌CICC10294、大腸桿菌CICC10662、金黃色葡萄球菌CICC10348、腸炎沙門氏菌CICC21482作為指示菌，利用雙層瓊脂牛津杯法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本文利用Edraw進(jìn)行細(xì)胞圖繪制；OriginPro 2016進(jìn)行圖表的制作；利用SPSS進(jìn)行顯著性分析；實(shí)驗(yàn)均為3次平行3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選結(jié)果

從新疆傳統(tǒng)乳制品奶酪、酥油、酸奶中共分離出163株菌株，其中有4株革蘭氏染色結(jié)果為陰性，9株過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，則共有150株菌株疑似為乳酸菌。經(jīng)16S rDNA分子學(xué)鑒定主要涵蓋4個(gè)屬11個(gè)種，見(jiàn)圖1。主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)：短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)63株、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)26株、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)12株、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)10株、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)5株、發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillusfermentum) 3株、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)3株；腸球菌屬(Enterococcus)：屎腸球菌(Enterococcusfaecium)8株、鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcusavium)4株；片球菌屬(Pediococcus)：戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)13株；魏斯氏菌屬(Weissella)：融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)3株。

圖1 部分乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of some lactic acid bacteria

分析發(fā)現(xiàn)，新疆傳統(tǒng)奶酪、酥油、酸奶中優(yōu)勢(shì)菌屬主要為乳桿菌屬，其中短乳桿菌、瑞士乳桿菌為主要的優(yōu)勢(shì)菌種。劉曉蓉[21]對(duì)新疆不同地區(qū)傳統(tǒng)酸奶樣品中的乳酸菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，德式乳桿菌為主要的優(yōu)勢(shì)菌種，張興吉[22]通過(guò)對(duì)青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、西藏地區(qū)的乳酸菌多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中青海地區(qū)以瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌與德式乳桿菌保加利亞亞種為主要的優(yōu)勢(shì)菌種，甘肅與新疆地區(qū)以瑞士乳桿菌為主要的優(yōu)勢(shì)菌種，內(nèi)蒙古地區(qū)以開(kāi)菲爾乳桿菌與瑞士乳桿菌為主要的優(yōu)勢(shì)菌種，西藏地區(qū)以副干酪乳桿菌、植物乳桿菌與德式乳桿菌保加利亞亞種為主要的優(yōu)勢(shì)菌種。與本文相比，在菌屬方面與其他研究者得到相同的結(jié)論，而在優(yōu)勢(shì)菌種上具有一定的差異，這可能是由于不同地區(qū)因海拔、溫度、氣候、季節(jié)、傳統(tǒng)工藝等不同，導(dǎo)致乳酸菌的分布具有一定的差異[23]。

2.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌篩選結(jié)果

2.2.1 薄層色譜結(jié)果

從150株乳酸菌中共篩選得到57株乳酸菌具有GABA合成能力，主要為短乳桿菌52株、屎腸球菌3株、戊糖片球菌2株，發(fā)現(xiàn)短乳桿菌在新疆傳統(tǒng)奶酪、酥油、酸奶中為主要的GABA合成菌種，并且Wu等[24]得到相同的結(jié)論，在篩選出的產(chǎn)GABA乳酸菌中，短乳桿菌為主要的關(guān)鍵菌種，這充分證明短乳桿菌在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，與GABA的形成有著緊密的聯(lián)系。并且發(fā)現(xiàn)并不是所有的短乳桿菌、戊糖片球菌、屎腸球菌均能夠合成GABA，這充分證明同一菌種的菌株之間的變異性，菌株合成GABA的能力取決于菌株本身，而非同一菌種的菌株之間都具有合成GABA的能力[25]。

圖2 部分乳酸菌發(fā)酵上清液薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatogram of some lactic acid bacteria fermentation supernatant

2.2.2 Berthelot法初步定量

圖3 Berthelot法定量結(jié)果Fig.3 Quantitative results by Berthelot method

通過(guò)Berthelot法繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3中A。短乳桿菌NL8 GABA合成能力最強(qiáng)，達(dá)到(4.25±0.1) mg/mL。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌GABA合成量均高于1 mg/mL，相比其他兩種菌種，在合成GABA方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，Barrett等[26]通過(guò)對(duì)人腸道內(nèi)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、齒雙歧桿菌以及短乳桿菌的GABA合成能力進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)短乳桿菌的合成量均高于其他菌種；Renes等[27]從巴西干酪中分離出產(chǎn)GABA的短乳桿菌以及乳酸乳球菌，發(fā)現(xiàn)短乳桿菌的合成量整體高于乳酸乳球菌；呂常江發(fā)現(xiàn)基于數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組或功能基因注釋的分析顯示短乳桿菌通常具有相對(duì)較高的GABA合成能力。充分證明短乳桿菌在合成GABA方面是一種很有價(jià)值的菌種。

2.2.3 HPLC精確定量

圖4 HPLC峰圖Fig.4 HPLC peak figure

由于Berthelot法定量可能會(huì)受培養(yǎng)基中其他游離氨基酸的影響[28]，因此利用HPLC法對(duì)短乳桿菌NL8進(jìn)行精確測(cè)量，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得回歸方程為y=140210996.8x-1323464.582，相關(guān)系數(shù)R=0.9993，證明GABA含量在0～0.5 mg/mL與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

經(jīng)HPLC精確測(cè)定，短乳桿菌NL8 的GABA合成量為(4.17±0.05) mg/mL，相比通過(guò)紫外誘變提高GABA合成量的植物乳桿菌CICC6238(1.196 mg/mL)、從韓國(guó)泡菜中分離出的短乳桿菌OPY-1(0.825 mg/mL)和短乳桿菌OPK-3(2.023 mg/mL)[29]等具有相對(duì)較高的合成量。

2.3 耐酸能力分析與膽鹽耐受性評(píng)價(jià)

2.3.1 耐酸能力

以2.2.1中篩選得到的不同菌種具有GABA合成能力的戊糖片球菌NL56(產(chǎn)量為(1.51±0.08) mg/mL，記作NL56)與不具備GABA合成能力的瑞士乳桿菌NL13(記作NL13)作為短乳桿菌NL8(記作NL8)的參照菌株，見(jiàn)圖5。在未加谷氨酸鈉(MSG)時(shí)，NL8、NL56、NL13均具有相對(duì)較好的耐酸能力，在pH 3條件下處理4 h后，存活率分別為(80.7±1.25)%、(73.39±0.905)%、(76.47±1.05)%，在pH 2.5條件下處理4 h后，存活率分別約為(69.27±0.658)%、(59.31±1.15)%、(62.8±0.675)%。通過(guò)對(duì)比，NL8具有更好的耐酸能力(p<0.05)，Wu等[30]的研究表明能夠合成GABA的乳酸菌一般具有較強(qiáng)的耐酸潛力，并建立一種新的方法，通過(guò)pH 6.5，1.5，4.0的連續(xù)酸化液體培養(yǎng)，結(jié)合后期產(chǎn)氣現(xiàn)象對(duì)產(chǎn)GABA乳酸菌進(jìn)行篩選，這表明產(chǎn)GABA乳酸菌一般具有較好的耐酸能力，但是可以發(fā)現(xiàn)NL13的耐酸能力強(qiáng)于NL56，這可能是由于乳酸菌具有多種耐酸機(jī)制且與谷氨酸脫羧酶的活性有一定的關(guān)系。

圖5 0.5%谷氨酸鈉對(duì)耐酸能力的影響Fig.5 Effect of 0.5% sodium glutamate on acid resistance

由圖5可知，當(dāng)加入MSG后，NL8與NL56的存活率在pH 3或pH 2.5的條件下處理4 h后，均有顯著增加(p<0.05)。NL8在pH 3或pH 2.5處理4 h后，存活率分別增加了約8.02%、6.04%，NL56存活率分別增加了約4.43%、3.75%，而不具備GABA合成能力的NL13存活率未發(fā)生改變。這種現(xiàn)象主要是由于產(chǎn)GABA乳酸菌所特有的谷氨酸脫羧酶(GAD)系統(tǒng)所導(dǎo)致的，見(jiàn)圖5中D。細(xì)胞在受到外界環(huán)境酸脅迫的條件下，細(xì)胞膜上的Glu/GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被激活，使得外界的谷氨酸或其鹽類進(jìn)入細(xì)胞，在胞質(zhì)中谷氨酸脫羧酶的作用下消耗胞內(nèi)H+并生成GABA，使得胞內(nèi)pH值回升，GABA由Glu/GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，由于GABA偏堿，導(dǎo)致胞外pH回升，從而使細(xì)胞內(nèi)外pH平衡，提高細(xì)胞在酸脅迫環(huán)境中的生存能力[31]?？梢园l(fā)現(xiàn)，NL8的存活率相比NL64增加的更多，這可能是由于NL8具有更強(qiáng)的GABA合成能力，其谷氨酸脫羧酶活性更強(qiáng)，在酸脅迫條件下，使胞內(nèi)外pH平衡的效率更高，從而有更多細(xì)胞存活。

2.3.2 膽鹽耐受性

圖6 膽鹽耐受性評(píng)價(jià)Fig.6 Evaluation of bile salt tolerance

由圖6可知，NL8的膽鹽耐受能力相比NL56較弱，NL56在含有0.15%、0.3%、0.4%膽鹽濃度的環(huán)境中，生長(zhǎng)滯后時(shí)間分別約為1，2.5，4 h，而NL8在0.15%膽鹽濃度下滯后時(shí)間約為4 h，膽鹽濃度為0.3%以上時(shí)，生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制，10 h內(nèi)OD620值仍未上升0.3，這主要是由于膽鹽可以通過(guò)破壞乳酸菌細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和脂肪酸從而引起細(xì)菌衰亡，而乳酸菌耐受膽鹽主要有兩種方式：通過(guò)分泌膽鹽水解酶降解膽汁鹽，使其正常生長(zhǎng)以及胞外多糖包裹細(xì)胞，防止膽鹽的破壞[32]。NL8膽鹽耐受能力較差，因此如何增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)膽鹽的耐受能力也變得尤為重要。

2.4 益生特性評(píng)價(jià)

2.4.1 胃腸道模擬耐受性

在2.3.1中通過(guò)對(duì)兩株菌的耐酸能力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩株菌均具有較好的耐酸能力，且通過(guò)添加0.5% MSG，在pH 3或pH 2.5處理3 h或4 h后，存活率均有顯著的提高，因此有必要確定MSG是否可以在胃腸道模擬過(guò)程中起到積極作用。

圖7 0.5%谷氨酸鈉對(duì)模擬胃腸道耐受能力的影響Fig.7 Effect of 0.5% sodium glutamate on simulated gastrointestinal tolerance

由圖7可知，在未加0.5%MSG的環(huán)境中，NL8經(jīng)人工胃液、腸液處理后存活率分別為(86.36±1.25)%、(80.5±1.05)%，NL56分別為(81.48±0.758)%、(71.08±0.865)%。史曉萌等通過(guò)對(duì)植物乳桿菌 CICC 6238以及從怡能菌粉中分離出的嗜酸乳桿菌NCFM和鼠李糖乳桿菌HN001進(jìn)行胃腸道模擬試驗(yàn)，最終存活率分別約為61.5%、79.4%、77.4%，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，NL8和NL56均具有較好的胃腸道耐受能力且NL8的耐受能力更強(qiáng)(p<0.05)。

在加入0.5% MSG后，經(jīng)人工胃液處理3 h、人工腸液處理6 h后，NL8和NL56的存活率相比未加MSG均顯著升高(p<0.05)，這主要是由于添加MSG后增強(qiáng)了NL8與NL56的耐酸能力(如2.3.1所述)，使得在人工胃液中處理3 h后細(xì)胞數(shù)增多，而人工腸液對(duì)乳酸菌的抑制作用是一定的，從而使得最終存活率顯著增加。因此，通過(guò)添加0.5% MSG可以有效改善NL8與NL56在人體胃腸道中的耐受情況。

2.4.2 抗氧化能力評(píng)價(jià)

通過(guò)對(duì)NL8與NL56的抗氧化能力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NL8具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，其完整細(xì)胞與無(wú)細(xì)胞提取物分別達(dá)到約(25.59±0.54)%、(42.29±0.87)%。李默[33]從發(fā)酵肉制品中分離出30株乳酸菌并對(duì)完整細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)清除范圍在0%～34.8%，而NL8的無(wú)細(xì)胞提取物高于這個(gè)范圍，并且相比嗜酸乳桿菌874(32.9%)、商業(yè)菌種嗜酸乳桿菌NCFM(22.6%)、植物乳桿菌ATCC14917(38.0%)[34]均高，則說(shuō)明NL8具有較強(qiáng)的DPPH清除能力。

圖8 抗氧化能力評(píng)價(jià)Fig.8 Evaluation of antioxidant capacity

通過(guò)對(duì)比李默、劉珊春[35]對(duì)發(fā)酵肉制品、傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中乳酸菌羥自由基清除能力和還原能力的測(cè)定結(jié)果，NL8與NL56清除羥自由基能力和還原能力適中，在清除羥自由基方面并無(wú)明顯差異(p>0.05)，在還原能力方面，NL56相比NL8具有更強(qiáng)的能力(p>0.05)。

2.4.3 抑菌能力評(píng)價(jià)

圖9 抑菌能力評(píng)價(jià)Fig.9 Evaluation of antibacterial ability

由圖9可知，NL8對(duì)大腸桿菌CICC10662與腸炎沙門氏菌CICC21482具有顯著的抑制作用(p<0.05)，抑菌圈直徑分別為(18.62±0.58) mm和(18.13±0.56) mm，而對(duì)金黃色葡萄球菌CICC10348與表皮葡萄球菌CICC10294的抑菌作用顯著較弱(p<0.05)，僅為(12.29±0.48) mm和(11.62±0.33) mm。Kim等[36]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將短乳桿菌DF01的粗細(xì)菌素與大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌共同孵育，能夠減少大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌的生物膜形成，從而起到抑制生長(zhǎng)的作用，證明大腸桿菌與沙門氏菌對(duì)短乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素較為敏感，因此抑制作用較強(qiáng)。

3 結(jié)論

從新疆傳統(tǒng)奶酪、酥油、酸奶各6份樣品中共分離出150株乳酸菌，主要涵蓋4個(gè)屬11個(gè)種，其中乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，短乳桿菌與瑞士乳桿菌為主要的優(yōu)勢(shì)菌種；通過(guò)利用薄層色譜法對(duì)產(chǎn)GABA乳酸菌進(jìn)行篩選，150株乳酸菌中共有57株乳酸菌具有合成GABA的能力，其中包括52株短乳桿菌、3株屎腸球菌、2株戊糖片球菌。利用Berthelot法與HPLC法進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌在合成GABA方面較有優(yōu)勢(shì)，且篩選出一株產(chǎn)量較高的菌株短乳桿菌NL8，產(chǎn)量達(dá)到(4.17±0.05) mg/mL。因此，選擇短乳桿菌NL8與具有GABA合成能力的戊糖片球菌NL56[(1.51±0.08) mg/mL]進(jìn)行后續(xù)益生特性的評(píng)價(jià)。

短乳桿菌NL8相比戊糖片球菌NL56具有更好的耐酸能力(p<0.05)，且與不具備GABA合成能力的瑞士乳桿菌NL13進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)添加0.5% MSG能夠使兩株菌在低pH的環(huán)境下耐受能力顯著增強(qiáng)(p<0.05)；短乳桿菌NL8相比戊糖片球菌NL56在耐膽鹽能力上較弱，短乳桿菌NL8在0.3%膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)開(kāi)始受到強(qiáng)烈抑制，而戊糖片球菌NL56能夠較好地耐受膽鹽進(jìn)行生長(zhǎng)；經(jīng)人工胃腸液處理，短乳桿菌NL8表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，且通過(guò)添加0.5% MSG可使兩株菌在人工胃液環(huán)境中耐受性顯著增強(qiáng)，從而提高最終存活率(p<0.05)；短乳桿菌NL8相比戊糖片球菌NL56具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(p<0.05)，且兩株菌均具有一定的羥自由基清除能力與還原能力；短乳桿菌NL8能夠顯著抑制大腸桿菌與腸炎沙門氏菌的生長(zhǎng)(p<0.05)，而對(duì)金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌的抑制作用較弱，戊糖片球菌NL56對(duì)指示菌均具有一定的抑制作用。

綜上所述，短乳桿菌NL8具有較強(qiáng)的GABA合成能力與優(yōu)良的益生特性，戊糖片球菌NL56雖然GABA合成量相對(duì)較低，但也具有較好的益生特性，且在今后的富含GABA發(fā)酵產(chǎn)品中，一般會(huì)殘留一定量的MSG，而本文已證明通過(guò)添加MSG可以增強(qiáng)兩株菌在胃腸道中的耐受能力，因此可作為優(yōu)良發(fā)酵劑用于后續(xù)功能性產(chǎn)品的研發(fā)。