李 喆 劉博男 張 超 華 悅 史 輯

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧大連116600； 2.國家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點實驗室， 遼寧大連116600； 3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心， 遼寧大連116600）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMillvar.spinosa （Bunge） Huex H.F chou 的干燥成熟種子。最早記載于《本草經(jīng)集注》，被譽為養(yǎng)心安神之上品中藥，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗生津的功效［1?2］。酸棗仁主要含有皂苷、黃酮、生物堿、脂肪酸等成分，其中黃酮和皂苷類為治療失眠的主要活性物質(zhì)［3?5］。酸棗仁傳統(tǒng)的炮制方法為清炒法［6］，《證類本草》［7］中記載，“睡多生使，不得睡炒熟”?！侗静菝审堋罚?］中亦有云，“能治多眠不眠，必分生用炒用。多眠膽實有熱，生研末；不眠膽虛有寒，炒作散”?，F(xiàn)代研究表明酸棗仁生品和炮制品均具有鎮(zhèn)靜安神作用，以炒酸棗仁的作用更強［9］?！侗静萸笳妗罚?0］中記載，“酸棗仁炒久油枯不香，碎則氣味俱失，便難見功”，可見炒制火侯對酸棗仁的功效發(fā)揮影響很大。

目前炒制酸棗仁缺乏具體的工藝參數(shù)，難以控制飲片質(zhì)量，影響臨床用藥的有效性。本實驗通過正交試驗，結(jié)合具有系統(tǒng)、靈活、簡潔的層次分析法，優(yōu)化炒制酸棗仁的炮制工藝參數(shù)。酸棗仁皂苷類主要為五環(huán)三萜類和四環(huán)三萜類結(jié)構(gòu)型皂苷，黃酮類主要為碳苷類，均為酸棗仁中鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁、抗焦慮等藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［11?13］。本實驗以酸棗仁中的斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸為指標(biāo)，采用正交設(shè)計結(jié)合層次分析法對酸棗仁的炒制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為工業(yè)大生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，為炮制原理解析提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695?2424 型高效液相色譜儀、蒸發(fā)光檢測器（美國Water 公司）；KQ?250E 型醫(yī)用超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；AE240 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；RE?52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Milli?Q凈水儀（法國Milipore 公司）；燃?xì)庠睿赖挠邢薰荆?/p>

1.2 材料 酸棗仁藥材收集于遼寧、河北、山東等省，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMillvar.spinosa （Bunge）Huex H.F chou 的干燥成熟種子。對照品斯皮諾素（批號N0604AS，純度＞98%）、酸棗仁皂苷A （批號A0703AS，純度＞98%）、6??阿魏酰斯皮諾素（批號N0605AS，純度＞98%）、白樺脂酸（批號O0930AS，純度＞98%） 均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。甲醇為色譜純，石油醚（60～90 ℃）、乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測定

2.1.1 對照品溶液制備 分別精密稱取斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸對照品適量，加甲醇溶液定容于10 mL 量瓶中，搖勻，即得對照品母液。分別吸取該對照品母液各2 mL于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含斯皮諾素0.274 mg／mL、6??阿魏酰斯皮諾素0.272 mg／mL、酸棗仁皂苷A 0.150 mg／mL、白樺脂酸0.292 mg／mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取酸棗仁飲片粉末，過4 號篩，精密稱定1 g，置索氏提取器中，加入石油醚（60～90 ℃） 100 mL，加熱回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，加入70%乙醇20 mL，加熱回流2 h，濾過，濾渣用5 mL 70%乙醇洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Ecosil 120?5?C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相乙腈（A） ?水（B），梯度洗脫 （0～12 min，20%～40% A；12～17 min，40% A；17～19 min，40%～95% A；19～30 min，95% A）；體積流量1 mL／min；柱溫35 ℃；氣體壓力40 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；漂移管溫度65 ℃［12］。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 取各個對照品溶液分別稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），以進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。測得斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸峰面積RSD 分別為1.36%、2.37%、1.99%、0.38%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測得斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸峰面積RSD分別為1.56%、1.99%、1.21%、0.21%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批次6 份酸棗仁樣品，每份1 g，精密稱定，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進(jìn)樣。測得斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸峰面積RSD 分別為2.29%、2.63%、1.50%、0.26%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量的酸棗仁飲片粉末6 份，每份1 g，按照比例對照品加入量?樣品中含有量約（1 ∶1） 加入對照品，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

2.2 炮制工藝優(yōu)化

2.2.1 多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法 根據(jù)層次分析法（AHP） 的原理［14?15］，利用yaahp v10.3 應(yīng)用軟件，將綜合OD值設(shè)為決策目標(biāo)，將斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸的權(quán)重系數(shù)設(shè)為方案層，建立判斷矩陣，判斷矩陣一致性比率（CR） ＜0.1，表明判斷矩陣一致性較好，求得的權(quán)重系數(shù)合理有效，無邏輯混亂，結(jié)果見表3。分別給予斯皮諾素0.341 6、6??阿魏酰斯皮諾素0.106 9、酸棗仁皂苷A 0.383 2、白樺脂酸0.168 2的權(quán)重系數(shù)，加權(quán)綜合評分，計算綜合OD值。

表3 工藝指標(biāo)準(zhǔn)則層判斷矩陣Tab.3 Criterion layer judgment matrix on process indicators

2.2.2 不同炮制工藝對比 分別將酸棗仁以烘箱105 ℃加熱3 min，微波800 W 加熱2 min，空氣炸鍋150 ℃加熱3 min 和130～140 ℃清炒1 min 進(jìn)行炮制，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進(jìn)樣，測得斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸的含有量，計算OD值，清炒法OD值最高。因此選擇清炒法作為進(jìn)一步考察的炮制工藝。結(jié)果見表4。

2.2.3 單因素考察 取酸棗仁飲片8 份，每份100 g，分別在100～110、110～120、120～130、130～140、140～150、150～160、160～170 ℃下炒制3 min，重復(fù)3 次，取平均值，測得斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸的含有量，對不同炒制溫度進(jìn)行評價，結(jié)果見圖2，表明炒制溫度140～150 ℃時OD值最高。

取酸棗仁飲片8 份，每份100 g，分別在140～150 ℃下炒制1、2、3、4、5、6、7、8 min，重復(fù)3 次，取平均值，測得4 種成分的含有量，對不同炒制時間進(jìn)行評價，結(jié)果見圖3，炒制時間1 min時OD值最高。

圖2 不同炒制溫度對OD 值的影響Fig.2 Effect of different cooking temperatures on OD values

2.2.4 正交試驗設(shè)計 通過對炒制溫度（A）、炒制時間（B） 進(jìn)行單因素考察，確定設(shè)計因素范圍為炒制溫度130～160 ℃，炒制時間30～90 s；采用正交設(shè)計軟件進(jìn)行最優(yōu)設(shè)計，每因素設(shè)置3 個水平，采用L9（34） 正交表設(shè)計試驗，見表5。

圖3 不同炒制時間對OD 值的影響Fig.3 Effect of different cooking times on OD values

表5 因素水平Tab.5 Factors and levels

2.2.5 正交試驗結(jié)果 分別取同一批酸棗仁飲片各100 g，按表5 中實驗設(shè)計進(jìn)行炮制。在“2.1.3” 項色譜條件下測定4 種成分的含有量。結(jié)果見表6。

2.2.6 結(jié)果分析 方差分析結(jié)果見表7。影響酸棗仁炒制的因素為炒制溫度 （A） 和炒制時間（B），炒制時間具有顯著性差異。酸棗仁炒制的最佳工藝為A1B2，即炒制溫度130～140 ℃，炒制時間60 s。

表6 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.6 Design and results of tests

表7 方差分析Tab.7 Analysis of variance

2.2.7 驗證試驗 按“2.2.6” 項下最佳工藝進(jìn)行3 次驗證試驗，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項條件下測定4 種成分的含有量，計算綜合OD值，結(jié)果見表8。由驗證試驗結(jié)果可知，綜合評分RSD 為2.98%。表明此方法穩(wěn)定，可靠，合理，可行。

表8 驗證試驗結(jié)果Tab.8 Results of validation tests

2.3 不同產(chǎn)地酸棗仁炒制前后化學(xué)成分的含有量比較 收集了10 批不同來源的酸棗仁，按“2.2.6” 項下工藝進(jìn)行炒制，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3” 項色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表9。

結(jié)果表明，酸棗仁經(jīng)炒制后斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、白樺脂酸的含有量均有不同程度的升高。

3 討論

2015 年版《中國藥典》 中酸棗仁的含有量測定指標(biāo)成分為斯皮諾素和酸棗仁皂苷A，且二者測定方法不同，不能同時測定。本實驗采用HPLC?ELSD 法，優(yōu)化色譜條件，能同時測定斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、6??阿魏酰斯皮諾素、白樺脂酸的含有量。酸棗仁炒制后，鎮(zhèn)靜催眠作用增強。對10 批不同產(chǎn)地酸棗仁炒制前后的化學(xué)成分分析顯示，酸棗仁皂苷A、斯皮諾素、6??阿魏酰斯皮諾素、白樺脂酸的含有量均有所增加，可能由于酸棗仁的炒制時間比較短，炒制溫度適中（文火），沒有造成皂苷、碳苷類成分的降解，而炒制過程中的迅速翻炒會促使酸棗仁中的水分損失，使組織結(jié)構(gòu)變得疏松，利于有效成分的溶出，這也是藥效活性提高的物質(zhì)基礎(chǔ)所在。

本實驗采用了層次分析法［16］，建立判斷矩陣，可以將人們的主觀思維嚴(yán)謹(jǐn)化，將各個指標(biāo)給予相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)，進(jìn)而結(jié)合加權(quán)評分優(yōu)化出酸棗仁炒制的最佳工藝，使其更具邏輯性和科學(xué)性。

本實驗通過單因素試驗分別選取了炒制溫度和炒制時間的最優(yōu)值，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，最終優(yōu)化出炒制酸棗仁的最佳工藝。由于炒制期間溫度較難固定在一個指定值，故本實驗溫度因素選取了一個區(qū)間值，且火力為文火，實時溫度計測定鍋中溫度，能夠較好的控制溫度在130～140 ℃之間，確保飲片質(zhì)量盡可能穩(wěn)定。

目前文獻(xiàn)報道酸棗仁的新型炮制方法有微波炮制、蜜炙等［17?18］，其加熱原理各不相同。然而清炒酸棗仁是最傳統(tǒng)且最常用的炮制方法，同時更適合工業(yè)大生產(chǎn)。根據(jù)實驗前期對不同炮制方法的比較以及最后得出的最佳炮制工藝可以看出，炮制溫度和炮制時間與酸棗仁飲片質(zhì)量緊密相關(guān)，且酸棗仁不宜炮制時間過長，進(jìn)而證實古籍中酸棗仁“久炒則油枯不香” 的論述。因此確定酸棗仁的最優(yōu)炮制條件，便能極大程度提高酸棗仁的飲片質(zhì)量。