高源，王大江，王昆，叢佩華，李連文，樸繼成

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

0 引言

【研究意義】蘋(píng)果屬（MalusMill.）為薔薇科（Rosaceae）植物，世界蘋(píng)果屬植物資源約35個(gè)種[1-2]，主要分布于北溫帶，橫跨歐亞大陸和北美洲；而原產(chǎn)中國(guó)的有27個(gè)種，其中野生近緣種21種、栽培種6種[3]。研究分析蘋(píng)果屬植物不同種的遺傳結(jié)構(gòu)，探討其遺傳多樣性，是揭示物種的進(jìn)化歷史[4-5]、分析其進(jìn)化潛力和未來(lái)命運(yùn)[6]、探討物種稀有或?yàn)l危原因[7-8]的重要方法，對(duì)制訂種質(zhì)資源保護(hù)策略、指導(dǎo)核心種質(zhì)資源篩選和相關(guān)優(yōu)異基因挖掘具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分子標(biāo)記是揭示不同品種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效手段[9]，RAPD[10]、AFLP[11]等分子標(biāo)記曾被用于蘋(píng)果的遺傳多樣性分析，SSR分子標(biāo)記被認(rèn)為是動(dòng)植物中最重要的標(biāo)記之一[12]，在蘋(píng)果遺傳多樣性研究中應(yīng)用最為廣泛[13]。SNP即單核苷酸多態(tài)性，是由單個(gè)核苷酸變異引起的 DNA序列多態(tài)性，SNP標(biāo)記是目前所有DNA分子標(biāo)記中多樣性最為豐富的標(biāo)記。研究SNP最徹底、最精確的方法即為直接測(cè)定某特定區(qū)域的核苷酸序列，與參照基因組中對(duì)應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行比較，從而檢測(cè)出具有多態(tài)性的單個(gè)核苷酸變異。SNP基因型鑒定已經(jīng)被應(yīng)用到許多作物的遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性評(píng)價(jià)和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[14-15]。CHAGNE等[16]利用EST-SNP標(biāo)記的方法對(duì)蘋(píng)果基因進(jìn)行了研究?，F(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，蘋(píng)果全基因組測(cè)序的完成，對(duì)于SNP在蘋(píng)果研究中的應(yīng)用具有重要的推動(dòng)作用。MICHELETTI等[17]對(duì) 27份蘋(píng)果屬種質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，并篩選出237個(gè)SNP標(biāo)記研究 260份蘋(píng)果品種的遺傳多樣性并構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。常源升等[18]、SUN等[19]和孫瑞[20]分別將SNP分子標(biāo)記的方法用于蘋(píng)果果形和果實(shí)品質(zhì)相關(guān)基因的主基因分析與QTL定位分析，劉更森[21]利用SNP標(biāo)記構(gòu)建了蘋(píng)果遺傳圖譜。隨著蘋(píng)果參考基因組的發(fā)表[22-24]，結(jié)合現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)，有利于在全基因組范圍內(nèi)尋找多態(tài)的SNP分子標(biāo)記用于蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，對(duì)于其保存和利用具有重要意義[25]。SLAF-seq（Specific Locus Amplified Fragment Sequencing）是一種高通量的簡(jiǎn)化基因組深度測(cè)序技術(shù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)最佳試驗(yàn)方案，在測(cè)序獲得海量特異性長(zhǎng)度的DNA片段（SLAF標(biāo)簽）基礎(chǔ)上，在全基因組范圍開(kāi)發(fā)出大量特異性SNP標(biāo)記。其已經(jīng)被應(yīng)用到多種作物，如水稻[26]、甘薯[27]、金花茶[28]和葡萄[29]等的SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)中，陶紅霞[30]基于SLAF技術(shù)開(kāi)發(fā)SNP構(gòu)建蘋(píng)果遺傳連鎖圖譜?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著近些年國(guó)家蘋(píng)果資源圃蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源收集和保存工作的不斷深入，國(guó)家蘋(píng)果資源圃保存了大量待鑒定的蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源，可在 SLAF-seq基礎(chǔ)上從全基因組開(kāi)發(fā) SNP標(biāo)記研究蘋(píng)果屬植物不同種的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在對(duì)國(guó)家蘋(píng)果種質(zhì)資源圃保存的15個(gè)種的427份蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源進(jìn)行高通量簡(jiǎn)化基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，解析15種蘋(píng)果屬植物種內(nèi)和種間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)，探討不同種間的系統(tǒng)演化關(guān)系，為不同種蘋(píng)果屬植物的鑒定評(píng)價(jià)以及進(jìn)一步收集和保存提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

427份蘋(píng)果種質(zhì)材料中有25份取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)公主嶺寒地果樹(shù)圃（吉林省公主嶺），1份滇池海棠和1份滄江海棠取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)云南特有果樹(shù)及砧木圃（云南省昆明），其余400份材料均取自國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城梨、蘋(píng)果圃（遼寧省興城市）。427份種質(zhì)分屬于蘋(píng)果屬的15個(gè)種，供試各種名稱及種質(zhì)來(lái)源見(jiàn)表1。于2017年春季采集健康幼嫩葉片，葉片經(jīng)硅膠干燥之后備用。

表1 用于SLAF測(cè)序分析的15個(gè)種蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源Table 1 Fifteen species of Malus Mill.germplasm resources for SLAF-seq analysis

1.2 基因組DNA的提取

采用德國(guó)QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取供試材料春季嫩葉的基因組DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)DeNovix，DS-11 型）檢測(cè)其濃度和純度，對(duì)照 λDNA（40 ng·μL-1）將提取基因組的DNA濃度調(diào)整到100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶切預(yù)測(cè)

以 2010年已經(jīng)發(fā)表的蘋(píng)果基因組作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)。參考基因組信息：蘋(píng)果（Malus pumilaMill.）基因組[22]（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=apple），組裝出的基因組大小為1 874.77 Mb，GC含量為45.32%。利用SLAF-predict軟件，通過(guò)蘋(píng)果基因組進(jìn)行方案預(yù)測(cè)，確定酶切組合并進(jìn)行酶切。

1.4 測(cè)序及數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)

將獲得酶切片段的3′端進(jìn)行加A處理，在加有polyA的酶切片段上連接測(cè)序接頭，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和切膠回收目的片段，構(gòu)建文庫(kù)。在 Illumina HiSeqTM2500（美國(guó)Illumina公司，HiSeq 2500型）上對(duì)檢驗(yàn)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)去接頭、低質(zhì)量閱讀框和污染處理而獲得干凈序列即SLAF標(biāo)簽。評(píng)估測(cè)序獲得序列的GC含量和Q30指標(biāo)，檢驗(yàn)測(cè)序質(zhì)量。

在不同樣品間有差異的 SLAF標(biāo)簽即為多態(tài)性SLAF標(biāo)簽。通過(guò)BWA軟件[31]將SLAF標(biāo)簽與蘋(píng)果參考基因組[22]以及在不同樣品間進(jìn)行比對(duì)，將其定位到參考基因組上獲得多態(tài)性的 SLAF標(biāo)簽。利用GATK[32]和SAMtools[33]兩種方法在多態(tài)性SLAF中開(kāi)發(fā) SNP，篩選兩種方法共同得到的 SNP作為開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)集。根據(jù)完整度＞0.94，次要等位基因頻率（MAF）＞0.05過(guò)濾[34]，篩選多態(tài)性的SNP，用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

1.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析

基于篩選的多態(tài)性 SNP，使用 MEGA 7[35]的 NJ（neighbor-joining）算法[36]，構(gòu)建蘋(píng)果屬不同種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。不同種間的遺傳距離大小用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分支長(zhǎng)度體現(xiàn)，長(zhǎng)度越短即代表兩份種質(zhì)之間的親緣關(guān)系越近。利用Admixture軟件[37]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，假設(shè)樣品的分群數(shù)（K）為 1—15進(jìn)行聚類(lèi)，根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率確定分群數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 建庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

利用 SLAF-predict軟件，參照2010年蘋(píng)果基因組進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)，確定選擇RsaI+HaeIII酶組合進(jìn)行酶切，篩選SLAF標(biāo)簽長(zhǎng)度范圍為314—414 bp，共預(yù)測(cè)到151 808個(gè)SLAF標(biāo)簽，SLAF標(biāo)簽在基因組上基本分布均勻。以水稻的測(cè)序數(shù)據(jù)（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）為對(duì)照進(jìn)一步評(píng)估酶切的有效性和酶切效率，將水稻的測(cè)序數(shù)據(jù)與蘋(píng)果參考基因組進(jìn)行比對(duì)，雙端比對(duì)效率為 95.19%，酶切效率為 92.79%，酶切反應(yīng)正常，SLAF建庫(kù)正常。

對(duì)所有供試蘋(píng)果屬植物種質(zhì)測(cè)序共獲得1 276.7 Mb的讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)，各種質(zhì)樣品獲得的讀長(zhǎng)數(shù)目在 1 189 223—1 968 102 bp，測(cè)序平均Q30為91.58%，所有測(cè)序樣品的Q30值均在80%以上；平均GC含量為40.04%，GC含量普遍較低。用于評(píng)估試驗(yàn)建庫(kù)準(zhǔn)確性的水稻測(cè)序獲得0.45 Mb數(shù)據(jù)量。測(cè)序結(jié)果的堿基錯(cuò)誤率低，測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到要求。

2.2 SLAF標(biāo)簽與多態(tài)性SNP標(biāo)記篩選

對(duì)427份蘋(píng)果屬植物種質(zhì)測(cè)序獲得586 454個(gè)SLAF標(biāo)簽，平均測(cè)序深度為 6.42 X。通過(guò) BWA軟件比對(duì)獲得463 612個(gè)多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，開(kāi)發(fā)5 896 021個(gè)群體SNP，根據(jù)完整度＞0.94、MAF＞0.05過(guò)濾，共得到46 460個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)，用于后續(xù)的群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)篩選的多態(tài)性 SNP在染色體上的分布，繪制多態(tài)性的 SNP在染色體上的分布圖（圖1）。

2.3 基于SNP標(biāo)記的蘋(píng)果屬植物親緣關(guān)系分析

以每個(gè)種作為一個(gè)種群，基于每個(gè)種群的 SNP標(biāo)記用 MEGA7計(jì)算蘋(píng)果屬各種間的遺傳距離（表2）。蘋(píng)果屬植物兩兩種間的遺傳距離為0—1.000，其中花葉海棠與變?nèi)~海棠、麗江山荊子、滇池海棠、湖北海棠、滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為1.000；變?nèi)~海棠與湖北海棠、滇池海棠、滄江海棠、隴東海棠、麗江山荊子和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；麗江山荊子與滇池海棠、湖北海棠、滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；滇池海棠與湖北海棠、滄江海棠，隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000，湖北海棠與滄江海棠、隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000；滄江海棠與隴東海棠和山楂海棠，隴東海棠和山楂海棠間的遺傳距離均為0.000。以種間遺傳距離做15個(gè)種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），15個(gè)種明顯分為 4個(gè)類(lèi)群，類(lèi)群Ⅰ為隴東海棠、山楂海棠、滇池海棠、滄江海棠、湖北海棠、麗江山荊子和變?nèi)~海棠，類(lèi)群Ⅱ?yàn)樯角G子，類(lèi)群Ⅲ為垂絲海棠、楸子、花紅和八棱海棠，類(lèi)群Ⅳ為中國(guó)蘋(píng)果、新疆野蘋(píng)果和花葉海棠。

圖1 多態(tài)性的SNP在染色體上的分布Fig.1 The distribution of polymorphic SNP in 17 chromosomes

表2 基于SNP的蘋(píng)果屬植物15個(gè)種間的遺傳距離Table 2 Genetic distance of 15 species of Malus Mill.based on SNP

圖2 基于SNP位點(diǎn)的蘋(píng)果屬15個(gè)種的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Polygenetic tree of 15 species of Malus Mill.based on SNP

2.4 基于SNP標(biāo)記的蘋(píng)果屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析能夠獲得個(gè)體的血統(tǒng)來(lái)源及其組成信息，是遺傳關(guān)系分析的一種重要手段。運(yùn)用Admixture軟件，分析 427份蘋(píng)果屬植物種質(zhì)基于多態(tài)性SNP的遺傳結(jié)構(gòu)。分別假設(shè)427份種質(zhì)的分群數(shù)（K值）為1—15（圖3），進(jìn)行聚類(lèi)。根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率，當(dāng)K=5的時(shí)候，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率有明顯降落，應(yīng)該為確定分群數(shù)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，首先確定所有供試蘋(píng)果屬植物的分群數(shù)為5，來(lái)自于5個(gè)可能的原始祖先。隨著進(jìn)一步的分化，當(dāng)K=14時(shí)，交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率最小，因此確定最佳分群數(shù)為14，反映了這些蘋(píng)果屬植物種質(zhì)分化后可能來(lái)自于 14個(gè)祖先。從 K=1—14的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析見(jiàn)圖4。

圖3 每個(gè)K值對(duì)應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率Fig.3 Cross validation error rates corresponding to every K values

當(dāng)確定分群數(shù)為5時(shí)，類(lèi)群Ⅰ包含25份種質(zhì)，有3份變?nèi)~海棠、3份垂絲海棠、1份麗江山荊子、1分新疆野蘋(píng)果和17份山荊子，其中有7份山荊子的Q值為1.000，這7份山荊子代表該類(lèi)群的基因庫(kù)（藍(lán)色基因庫(kù)）。類(lèi)群Ⅱ包含190份種質(zhì)，有1份八棱海棠、1份垂絲海棠、4份花紅、5份楸子、1份山荊子、20份中國(guó)蘋(píng)果和158份新疆野蘋(píng)果，其中有63份新疆野蘋(píng)果和1份中國(guó)蘋(píng)果（新疆）的Q值為1.000，這63份新疆野蘋(píng)果和1份中國(guó)蘋(píng)果代表該類(lèi)群體的基因庫(kù)（綠色基因庫(kù)）。類(lèi)群Ⅲ包含55份種質(zhì)，有3份八棱海棠、1份滄江海棠、2份垂絲海棠、1份滇池海棠、12份花紅、1份花葉海棠、4份隴東海棠、16份楸子、4份山定子、1份山楂海棠和10份中國(guó)蘋(píng)果，其中有1份八棱海棠、1份花紅、1份山荊子、1份中國(guó)蘋(píng)果和1份楸子的Q值為1.000，這5份材料代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（淡綠色基因庫(kù)）。類(lèi)群Ⅳ包含119份種質(zhì)，有2份八棱海棠、3份垂絲海棠、1份湖北海棠、2份楸子、2份新疆野蘋(píng)果、2份中國(guó)蘋(píng)果和107份山荊子，其中有26份山荊子的Q值為1.000，26份山荊子代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（黃色基因庫(kù)）。類(lèi)群Ⅴ包括39份種質(zhì)，有28份八棱海棠、3份花紅、2份楸子、4份山定子和1份中國(guó)蘋(píng)果，其中16份八棱海棠和1份楸子的Q值為1.000，該17份種質(zhì)代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（淺黃色基因庫(kù)）。

圖4 427份15種蘋(píng)果屬植物種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)（K=5和K=14）Fig.4 The genetic structure of 427 accessions of 15 species of Malus Mill.(K=5 and K=14)

當(dāng)確定分群數(shù)為14時(shí)，類(lèi)群1包含24份種質(zhì)，有14份八棱海棠、3份花紅、1份楸子、1份山荊子和5份中國(guó)蘋(píng)果，其中有3份中國(guó)蘋(píng)果（綿蘋(píng)果）的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（藏藍(lán)色基因庫(kù)）。類(lèi)群2包含37份種質(zhì)，有1份楸子、1份中國(guó)蘋(píng)果和35份新疆野蘋(píng)果，其中有2份新疆野蘋(píng)果的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（綠色基因庫(kù)）。類(lèi)群3包含5份種質(zhì)，全部為山荊子，且全部為內(nèi)蒙古收集的山荊子，其Q值全部為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（淺綠色基因庫(kù)）。類(lèi)群4包含16份種質(zhì)，有10份中國(guó)蘋(píng)果、2份花紅、2份楸子、1份八棱海棠和1份垂絲海棠，其中有5份中國(guó)蘋(píng)果（2份綿蘋(píng)果和3份檳子）的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（淺黃色基因庫(kù)）。類(lèi)群5包含38份種質(zhì)，有1份中國(guó)蘋(píng)果，其余全部為山荊子，其中有6份山荊子的Q值為0.9999，此6份山荊子全部為內(nèi)蒙古收集到的山荊子，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（黃色基因庫(kù)）。類(lèi)群6包含124份種質(zhì)，除4份中國(guó)蘋(píng)果、1份山荊子和2份楸子外，其余全部為新疆野蘋(píng)果，且有11份新疆野蘋(píng)果的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（深黃色基因庫(kù)）。類(lèi)群7包含了6份種質(zhì)，全部為新疆野蘋(píng)果，且Q值全部為0.9999，該類(lèi)群為由新疆野蘋(píng)果全部代表的類(lèi)群（土黃色基因庫(kù)）。類(lèi)群8包含28份種質(zhì)，有2份花紅、4份山荊子、8份中國(guó)蘋(píng)果、3份垂絲海棠、8份楸子和3份八棱海棠，其中有1份中國(guó)蘋(píng)果、1份山荊子、1份花紅、1份楸子和2份八棱海棠的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群基因庫(kù)（橘色基因庫(kù)）。類(lèi)群9包含12份種質(zhì)，有4份隴東海棠、1份滇池海棠、1份滄江海棠、1份山楂海棠、1份花葉海棠、3份變?nèi)~海棠和1份楸子，其中除 3份變?nèi)~海棠外的 9份種質(zhì)的 Q值全部為0.9999，代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（紅色基因庫(kù)）。類(lèi)群10包含13份種質(zhì)，有4份八棱海棠和9份山荊子，其中占比最重的為深藍(lán)色基因庫(kù)，但無(wú)純深藍(lán)色基因庫(kù)的種質(zhì)，全部為多種基因庫(kù)混雜的種質(zhì)。類(lèi)群 11包含32份種質(zhì)，有1份麗江山荊子、1份花紅、1份中國(guó)蘋(píng)果、4份垂絲海棠、2份新疆野蘋(píng)果和23份山荊子，其中有9份山荊子和1份垂絲海棠的Q值為0.9999，9份山荊子來(lái)源于黑龍江和內(nèi)蒙古，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（藍(lán)色基因庫(kù)）。類(lèi)群12包含12份種質(zhì)，由 1份楸子和 11份八棱海棠組成，其中有 7份八棱海棠的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（淺藍(lán)色基因庫(kù)）。類(lèi)群13包含51份種質(zhì)，除1份垂絲海棠、1份湖北海棠、1份八棱海棠、1份新疆野蘋(píng)果和3份楸子外，其余全部為山荊子，其中有5份山荊子的Q值為0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（天藍(lán)色基因庫(kù)）。類(lèi)群 14包含 28份種質(zhì)，由 10份花紅、9份山荊子、3份中國(guó)蘋(píng)果和6份楸子組成，其中 2份楸子、2份花紅和 1份中國(guó)蘋(píng)果的Q值≥0.9999，其代表了該類(lèi)群的基因庫(kù)（湖藍(lán)色基因庫(kù)）。只由一個(gè)種來(lái)代表一個(gè)基因庫(kù)的類(lèi)群有類(lèi)群 1、類(lèi)群2、類(lèi)群3、類(lèi)群4、類(lèi)群5、類(lèi)群6、類(lèi)群11、類(lèi)群12、類(lèi)群13，代表種分別為中國(guó)蘋(píng)果（綿蘋(píng)果）、新疆野蘋(píng)果、山荊子（內(nèi)蒙古）、中國(guó)蘋(píng)果（綿蘋(píng)果和檳子）、山荊子（內(nèi)蒙古）、新疆野蘋(píng)果、山荊子（黑龍江和內(nèi)蒙古）、八棱海棠、山荊子（黑龍江）。

3 討論

SNP變異通常由單個(gè)核苷酸堿基的替換、較小片段的插入或缺失引起[38]，其類(lèi)型有單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、摻入和缺失以及小片段的摻入缺失（InDel）。大多數(shù)的SNP并不直接體現(xiàn)在表型上，位于基因的非編碼區(qū)，但卻能夠體現(xiàn)群體間的遺傳和生物進(jìn)化關(guān)系，可作為遺傳標(biāo)記而應(yīng)用于動(dòng)植物的群體遺傳關(guān)系和進(jìn)化研究[39-40]。在動(dòng)植物研究的諸多方面均有應(yīng)用，諸如果蠅和小鼠[41]等動(dòng)物以及擬南芥[42]、水稻[43]和小麥[44]等植物。SLAF測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了SNP標(biāo)記在多種植物的種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、遺傳進(jìn)化以及性狀關(guān)聯(lián)分析中的研究，諸如玉米[45]、小麥[46]、棉花[47]、茶樹(shù)[48]、大豆[49]和葡萄[50]等。本研究在 SLAF測(cè)序的基礎(chǔ)之上開(kāi)發(fā)了46 460個(gè)多態(tài)性的SNP標(biāo)記，分析了15種蘋(píng)果屬植物的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)，探討不同種間和種內(nèi)的系統(tǒng)演化關(guān)系。

基于種群間遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育分析以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析均表明，15種蘋(píng)果屬植物分為4個(gè)基本的類(lèi)群，基于種間遺傳距離進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，花葉海棠與新疆野蘋(píng)果的遺傳距離只有0.019，與群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果有所偏差，有可能是供試的15個(gè)種在以種作為種群分析時(shí)，各種群內(nèi)個(gè)體數(shù)量差異較大造成的分析結(jié)果有所偏差。

蘋(píng)果屬植物的遺傳結(jié)構(gòu)分析中，在K=5和K=14兩種分群情況下，隴東海棠、變?nèi)~海棠、花葉海棠、滇池海棠、滄江海棠和山楂海棠均在同一類(lèi)群中，基因來(lái)源和背景相似。6個(gè)野生種中，除山楂海棠主要分布在中國(guó)吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)，其余5個(gè)種在中國(guó)的西南地區(qū)均有野生分布。隴東海棠、變?nèi)~海棠、花葉海棠和山楂海棠葉片均有裂刻，只是裂刻的深淺不一。這6個(gè)蘋(píng)果屬植物的野生種可能具有相似的起源種，但在演化過(guò)程中逐漸出現(xiàn)分化。

當(dāng)K=5時(shí)，類(lèi)群2和類(lèi)群3的中國(guó)蘋(píng)果中均有來(lái)自于山荊子代表的純基因庫(kù)（藍(lán)色基因庫(kù)）基因，兩個(gè)類(lèi)群中各有1份中國(guó)蘋(píng)果種質(zhì)具有該類(lèi)群的純基因庫(kù)，類(lèi)群3的中國(guó)蘋(píng)果含有極少量的新疆野蘋(píng)果基因。此外，八棱海棠具有純的基因庫(kù)，其在遺傳結(jié)構(gòu)中的作用被突顯出來(lái)。新疆野蘋(píng)果和山荊子都有比較純的基因庫(kù)，中國(guó)蘋(píng)果的基因并不全來(lái)自于新疆野蘋(píng)果，而有山荊子基因的加入，并與栽培種的關(guān)系密切。

當(dāng)K=14時(shí)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，中國(guó)原產(chǎn)蘋(píng)果屬植物有9個(gè)比較純的同源基因庫(kù)，其中有2個(gè)為中國(guó)蘋(píng)果的同源基因庫(kù)，2個(gè)為新疆野蘋(píng)果的同源基因庫(kù)，3個(gè)為山荊子的同源基因庫(kù)，中國(guó)蘋(píng)果中的部分綿蘋(píng)果和檳子、新疆野蘋(píng)果、內(nèi)蒙古和黑龍江的山荊子、八棱海棠代表了較為原始的基因來(lái)源。部分中國(guó)蘋(píng)果的種質(zhì)中有新疆野蘋(píng)果和山荊子的基因背景，再次證明部分中國(guó)蘋(píng)果在起源演化過(guò)程中有新疆野蘋(píng)果和山荊子的參與，這與 DUAN等[51]的結(jié)論一致。但中國(guó)蘋(píng)果中還有一部分綿蘋(píng)果（主要指彩蘋(píng)）和檳子可以獨(dú)立代表類(lèi)群基因庫(kù)，其基因庫(kù)中并沒(méi)有新疆野蘋(píng)果的參與，其所在類(lèi)群與山荊子以及蘋(píng)果屬植物的栽培種花紅、楸子和八棱海棠密切相關(guān)。花紅、楸子和八棱海棠與山荊子的親緣關(guān)系更近，與蘋(píng)果屬植物其他野生種之間的親緣關(guān)系也近于與新疆野蘋(píng)果的親緣關(guān)系。而根據(jù)李育農(nóng)[3]的理論，中國(guó)蘋(píng)果起源于新疆野蘋(píng)果，在中國(guó)有近2 000年的栽培歷史，其作為“西洋蘋(píng)果”（Malus domesticaBorkh.）引入中國(guó)之前的中國(guó)特有種，與“西洋蘋(píng)果”有著不同的起源和演化過(guò)程。分析此種情況產(chǎn)生的原因，一是按照CAO等[52]的理論，人類(lèi)活動(dòng)可以造成SNP多態(tài)性的迅速降低。如果蘋(píng)果屬植物栽培種中國(guó)蘋(píng)果起源于新疆野蘋(píng)果，在從新疆野蘋(píng)果向中國(guó)蘋(píng)果的演化過(guò)程中，由于人為參與活動(dòng)而使SNP多態(tài)性迅速降低，取而代之的是與其地理位置相近的蘋(píng)果屬其他種對(duì)其造成的影響；二是中國(guó)蘋(píng)果中部分類(lèi)型本身可能也是一個(gè)起源種，其起源演化過(guò)程與新疆野蘋(píng)果可能并不相關(guān)。此次供試的中國(guó)蘋(píng)果大多數(shù)來(lái)源于中國(guó)的華北地區(qū)，來(lái)源于廢棄果園旁、靠近果園的山坡或者農(nóng)家院，與新疆野蘋(píng)果原始集中分布區(qū)相距甚遠(yuǎn)。即使是人類(lèi)活動(dòng)和鳥(niǎo)獸等對(duì)新疆野蘋(píng)果向中國(guó)蘋(píng)果的馴化過(guò)程有一定影響，也不足以使新疆野蘋(píng)果基因在部分供試的中國(guó)蘋(píng)果中幾乎完全消失。因此，中國(guó)蘋(píng)果與新疆野蘋(píng)果的起源演化關(guān)系有待于進(jìn)一步考究。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因重測(cè)序成本的降低，全基因組范圍零缺失的SNP標(biāo)記挖掘?qū)橄嚓P(guān)研究提供更多的證據(jù)。

4 結(jié)論

利用SLAF技術(shù)快速挖掘覆蓋全基因組的46 460個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，對(duì)427份15種中國(guó)原產(chǎn)蘋(píng)果屬植物種內(nèi)和種間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。15種蘋(píng)果屬植物分為4個(gè)基本的類(lèi)群，一是山荊子類(lèi)群，二是新疆野蘋(píng)果和少數(shù)中國(guó)蘋(píng)果類(lèi)群，三是變?nèi)~海棠、花葉海棠、隴東海棠、山楂海棠、滇池海棠和滄江海棠類(lèi)群，四是4個(gè)蘋(píng)果屬植物栽培種中國(guó)蘋(píng)果、八棱海棠、花紅和楸子類(lèi)群。中國(guó)原產(chǎn)蘋(píng)果屬植物栽培種中國(guó)蘋(píng)果中部分種質(zhì)的起源演化過(guò)程有山荊子和新疆野蘋(píng)果的參與，中國(guó)蘋(píng)果與其他栽培種的親緣關(guān)系密切，其與新疆野蘋(píng)果的起源演化關(guān)系有待進(jìn)一步考究。