何 瑛，魏學(xué)花

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是以骨髓造血干細胞的過度增殖為主要特征的惡性腫瘤之一[1]，其主要包括慢性粒細胞白血病、真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥以及原發(fā)性骨髓纖維化[2]。目前對于骨髓增殖性腫瘤疾病的發(fā)病機制尚不明確，隨著基因測序手段的不斷提升，越來越多研究顯示，骨髓增殖性腫瘤與多種基因的突變相關(guān)[3]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)與組蛋白以及DNA的合成具有重要的作用，DNMT3A基因突變存在于多種惡性血液病中，且參與惡性血液病的發(fā)生、發(fā)展。MPL W515對于調(diào)控DNA的修飾具有重要作用，MPL W515突變可繼發(fā)激活JAK-STAT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起MPN發(fā)生。JAK2 exon12突變與腫瘤的進展以及增殖具有重要聯(lián)系。研究報道顯示[4]，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因的突變與骨髓增殖性腫瘤患者的危險層級相關(guān)，同時根據(jù)患者的基因突變以及危險分級，及時采取相應(yīng)的干預(yù)措施，可提升患者的治療效果，本研究通過對MPN患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率、突變類型的檢測，分析其與預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本次研究對象均來自于2010年2月-2015年4月在銀川市第一人民醫(yī)院治療的骨髓增殖性腫瘤患者，共120例，其中，男性57例，女性63例；50歲以下27例，51～60歲51例，61～70歲42例；病程0～2年59例，3～5年61例.根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷以及分類標準，真性紅細胞增多癥(PV)患者31例，原發(fā)性血小板增多癥(ET)患者29例，原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)患者12例，慢性髓性白血病患者(CML)48例；根據(jù)核型分析結(jié)果顯示，預(yù)后良好組患者56例，中度風(fēng)險組患者42例，不良風(fēng)險組患者22例。本研究經(jīng)銀川市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或其家屬均對此次研究知情且簽署知情同意書。

納入標準：①所有患者均符合骨髓增殖性腫瘤診斷標準[5]；②所有患者入院前均未進行抗腫瘤治療；③患者均未有腫瘤遠處轉(zhuǎn)移；④已獲得患者及家屬知情同意。排除標準：①嚴重心臟、肝、腎功能障礙的患者；②入院前3個月內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素或受體拮抗劑類藥物；③中途停止治療或者轉(zhuǎn)院患者。

1.2 研究方法：基因檢測，分別對所有患者采集外周血4 mL，3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，加入等體積的異丙醇，以Trizol試劑進行總RNA提取，以PCR方法進行擴增，DNMT3A檢測上游引物設(shè)定為5′-TACATCTGGCTACTGGGTGTCGTATC-3′，下游引物設(shè)定為：5′-TCGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，MPL W515檢測的上游引物設(shè)定為5′-CCGCTCGAGCCCTCCCCCAAAC-3′，下游引物設(shè)定為5′-GAATGCGGCCGCCTGGGAGTGGTAAAAGGGGAGGAT-3′，JAK2 exon12上游引物設(shè)定為5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′，以5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3為下游引物，采用半巢式聚合酶鏈式反應(yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性分析方法對患者樣本的基因進行突變分型。

1.3 觀察指標

1.3.1 不同預(yù)后風(fēng)險患者的基礎(chǔ)資料比較：分別對預(yù)后良好組患者、中度風(fēng)險組患者、不良風(fēng)險組患者的性別、臨床類型、年齡、血脂情況、糖尿病、高血壓患病情況進行比較。

1.3.2 不同預(yù)后組患者基因突變情況分析：分別對預(yù)后良好組患者、中度風(fēng)險組患者、不良風(fēng)險組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的差異分析。

1.3.3 不同生存期患者的基因突變情況分析：分別對患者開展5年的生存分析，比較生存患者與死亡患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的差異。

1.3.4 患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預(yù)后風(fēng)險之間的相關(guān)性分析：采用spearman相關(guān)性分析，對患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預(yù)后風(fēng)險之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)后風(fēng)險患者的基礎(chǔ)資料比較：分別對不同預(yù)后組患者的基礎(chǔ)資料進行比較，不同預(yù)后組患者的性別、年齡、疾病類型、BMI、慢性病患病情況之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同預(yù)后風(fēng)險患者的基礎(chǔ)資料比較

2.2 不同預(yù)后組患者基因突變情況分析：隨著不良預(yù)后風(fēng)險的增高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不良預(yù)后組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變類型主要表現(xiàn)為TT、AT以及GG基因的突變，見表2。

表2 不同預(yù)后組患者基因突變的分布[n(%)]

2.3 不同生存期患者的基因突變率分析：通過對患者的5年的生存分析，生存患者90例，死亡患者30例，通過對患者不同生存期患者的基因突變情況分析，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著高于生存組(P<0.05)。而在患者的基因突變型的分析中，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變主要表現(xiàn)為TT基因型的突變，見表3。

表3 不同生存期患者的基因突變分布[n(%)]

2.4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預(yù)后風(fēng)險之間的相關(guān)性：患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預(yù)后風(fēng)險呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變與生存情況、預(yù)后風(fēng)險之間的相關(guān)性分析

3 討論

骨髓增殖性腫瘤是患者的造血干細胞在分化過程中的異常增殖，造成患者的異質(zhì)性基因突變性疾病。隨著患者的疾病惡化，患者可能逐步發(fā)展為骨髓纖維化，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生[6]。有流行病學(xué)調(diào)查顯示[7]，骨髓增殖性腫瘤疾病的生存情況不一，可在數(shù)月到20年之間。骨髓增殖性腫瘤疾病的發(fā)病機制以及預(yù)后的評價因素分析，有研究報道指出[8]，患者的疾病類型、年齡、細胞遺傳學(xué)以及核酸物質(zhì)的差異均可導(dǎo)致患者的生存以及預(yù)后的差異。目前對于骨髓增殖性腫瘤患者的基因突變診斷已經(jīng)成為疾病診斷的特異性指標之一，同時也是作為臨床靶向治療的研究重點。近年來隨著基因測序手段的不斷發(fā)展，骨髓增殖性腫瘤患者的發(fā)病基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多的相關(guān)性[9]。眾多研究指出[10-11]，基因的突變不僅是骨髓增殖性腫瘤的疾病進展的標志，同時也可作為患者的不同預(yù)后的重要指標。

本研究中，通過對患者的預(yù)后以及生存情況的分析顯示，在不同預(yù)后組及不同生存期組患者中，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的發(fā)生率有顯著差異，隨著預(yù)后不良風(fēng)險升高，患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變的發(fā)生率有顯著增加，死亡組患者的DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率顯著高于生存組，DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變率與生存情況、預(yù)后風(fēng)險呈現(xiàn)正相關(guān)。分析認為，DNMT3A基因與DNA的甲基化顯著相關(guān)，對于腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄具有顯著的沉默作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)[12]，單一的DNMT3A基因突變并不會造成患者的疾病進展，但是也有研究發(fā)現(xiàn)[13]，患者的DNMT3A基因突變不屬于單一事件的發(fā)生，往往與影響患者疾病進展的多種基因的突變相互影響，進而造成疾病的進展。JAK2是造成骨髓增殖性腫瘤患者進展的關(guān)鍵性因素，是JAK家族的重要成員之一，而JAK家族是對腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄具有指導(dǎo)性作用。通過JAK-STAT途徑對患者的細胞表面多種受體，特別是細胞因子的信號通路受體的調(diào)控，對腫瘤細胞的增殖以及分化進行調(diào)節(jié)，而JAK2 exon12基因作為JAK2基因的亞型，同樣對患者的腫瘤細胞的增殖分化具有重要的調(diào)控作用。隨著該基因的失控、變異，患者的腫瘤細胞的調(diào)節(jié)受到嚴重干擾，腫瘤細胞呈現(xiàn)無序生長，進而表現(xiàn)為腫瘤疾病的進展以及生存期的縮短。而MPL W515基因的突變已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為骨髓增殖性腫瘤的特異性診斷依據(jù)，該基因的突變主要是通過對患者的MPL/TPOR跨膜運動中的色氨酸進行改變，將其替換為亮氨酸或賴氨酸，進而導(dǎo)致突變的細胞對于細胞因子的依賴性降低，進而發(fā)生異常增殖現(xiàn)象，同時有研究報道指出[14]，其對于JAK-STAT途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有顯著的激活作用，進而刺激疾病的進展，所以從分子生物學(xué)的分析顯示，三種基因的突變并不是相互獨立，而是相互影響，進而促使患者的疾病進展。張葉華等[15]通過對骨髓增殖性腫瘤患者的DNMT3A基因突變與疾病的預(yù)后分析顯示，隨著患者DNMT3A基因突變率的升高，患者的不良預(yù)后風(fēng)險顯著升高。何志鵬等[16]通過對患者的JAK2 exon12基因突變與骨髓增殖性腫瘤發(fā)展為白血病的風(fēng)險研究，患者的白血病轉(zhuǎn)化率與患者的JAK2 exon12基因突變情況呈現(xiàn)正相關(guān)。王怡斐等[17]通過對患者的骨髓增殖性細胞的MPL W515基因的突變與疾病的診斷分析顯示，患者的該基因突變發(fā)生率與患者的危險分層相關(guān)，與本研究相互印證。

綜上所述，骨髓增殖性腫瘤患者DNMT3A、MPL W515、JAK2 exon12基因突變可能與患者的預(yù)后相關(guān)，未來可作為患者診斷與治療的重要靶點。