唐向民 楊守臻 陳懷珠 孫祖東 賴振光 曾維英 韋清源

摘?要：為分析栽培大豆和野生大豆線粒體基因組的密碼子使用特征差異，該文以其線粒體基因組編碼序列為研究對象，比較其密碼子偏性形成的影響因素和演化過程。結(jié)果表明：（1）栽培大豆和野生大豆線粒體基因組編碼區(qū)的GC含量分別為44.56%和44.58%，說明栽培大豆和野生大豆線粒體編碼基因均富含?A/T?堿基。（2）栽培大豆和野生大豆線粒體基因組密碼子第1位、第2位GC含量平均值與第3位GC含量的相關(guān)性均呈極顯著水平，說明突變在其密碼子偏性形成中的作用不可忽略;PR2-plot?分析顯示，在同義密碼子第3位堿基的使用頻率上，嘌呤低于嘧啶;?Nc-plot分析中Nc比值位于-0.1～0.2區(qū)間的基因數(shù)占總基因數(shù)的95%以上;突變和選擇等多重因素共同作用影響了大豆線粒體基因組編碼序列密碼子使用偏性的形成。（3）有20、21個密碼子分別被確定為栽培大豆和野生大豆線粒體基因組編碼序列的最優(yōu)密碼子，其中除絲氨酸TCC密碼子外均以A或T結(jié)尾。綜上結(jié)果認(rèn)為，栽培大豆線粒體密碼子偏性的形成受選擇的影響要高于野生大豆，這可能是栽培大豆由野生大豆經(jīng)長期人工栽培馴化的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：栽培大豆，野生大豆，線粒體基因組，密碼子使用偏性，最優(yōu)密碼子

中圖分類號：S565.1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）07-0926-09

Abstract：The?characteristic?of?codon?usage?in?mitogenome?of?wild?and?cultivated?soybean?was?studied?and?compared?to?explore?the?main?factors?affecting?codon?usage?bias?and?codon?evolution.?The?results?were?as?follows：（1）?The?GC?content?in?the?coding?region?of?mitochondrial?genome?of?cultivated?soybean?and?wild?soybean?was?44.56%?and?44.58%，respectively，which?indicated?that?the?coding?sequences?of?soybean?mitogenome?was?rich?in?A/T?base.?（2）?PR2-plot?analysis?showed?that?the?third?base?of?codon?usage?was?biased，where?pyrimidine?was?used?more?frequently?than?purine;?Nc-plot?analysis?revealed?that?the?number?of?genes?with?Nc?ratio?in?the?range?of?-0.1-0.2?accounts?for?more?than?95%?of?the?total?number?of?genes.?The?above-mentioned?results?showed?that?the?multiple?factors?such?as?mutation?and?selection?affected?the?formation?of?codon?usage?bias?in?soybean?mitogenome.?GC1?and?GC2?value?was?significantly?correlated?with?GC3，suggesting?that?codon?bias?in?the?mitogenome?of?cultivated?and?wild?soybeans?was?mainly?affected?by?mutation.?（3）?In?addition，20?and?21?codons?were?identified?to?be?the?optimal?codons?for?the?mitogenome?of?cultivated?and?wild?soybeans，with?most?of?the?preferred?synonymous?codons?ending?with??A?or?T?base.?The?formation?of?mitochondrial?codon?bias?of?cultivated?soybean?was?more?affected?by?selection?than?that?of?wild?soybean，which?may?be?the?result?of?long-term?artificial?cultivation?and?domestication?of?cultivated?soybean.

Key?words：Glycine?max，Glycine?soja，mitogenome，codon?usage?bias，optimal?codon

同義密碼子使用偏好性是指編碼序列中同義密碼子被生物體偏愛使用的不同頻率（Qiu?et?al.，2011;Hanson?et?al.，2018）。由于生物界通用密碼子的簡并性，每個氨基酸至少對應(yīng)1種密碼子，最多有6種對應(yīng)的密碼子。同義的三聯(lián)體密碼子通常不是被隨機使用的，這種偏好性確保了最優(yōu)密碼子可以與數(shù)量最多tRNA基因的反密碼子配對（Sun?et?al.，2009）。同時避免了氨基酸的錯摻，減少了翻譯加工差錯（Wei?et?al.，2014）。研究同義密碼子使用的偏好性以及導(dǎo)致其形成的因素，可以幫助更好地了解生物基因組的特征、分子進化以及生態(tài)適應(yīng)性等。之前關(guān)于陸地植物全基因組和葉綠體基因組密碼子偏性的相關(guān)研究較多（Mazumdar?et?al.，2017），但植物線粒體基因組的密碼子使用模式及其相關(guān)作用力尚未得到很好的研究。

作為一種細胞核外的遺傳系統(tǒng)，線粒體基因組具有重排進化快、葉綠體DNA插入等結(jié)構(gòu)特點。目前，對線粒體基因組的研究主要體現(xiàn)在對基因的結(jié)構(gòu)和功能、基因表達的時空調(diào)控、核質(zhì)互作、分子進化規(guī)律、物種的起源進化以及線粒體的起源等生物學(xué)領(lǐng)域的研究（夏玉玲等，2008;Kong?et?al.，2013）。?mtDNA已被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、種內(nèi)母系演化、種間系統(tǒng)發(fā)育、種群系統(tǒng)進化及遺傳多樣性分析等方面的研究（Galtier?et?al.，2009;?Wei?et?al.，2014;?農(nóng)全東等，2019;?李平等，2019）。高等植物的線粒體基因組具有RNA編輯和密碼子偏好性等特殊的表達方式（李玉秋等，2011）。了解植物線粒體基因組密碼子的使用偏好，可以更好地了解其線粒體基因組進化過程。

大豆是豆科大豆屬一年生草本植物。一年生野生大豆（Glycine?soja）為栽培大豆（G.?max）的祖先種，是開展栽培大豆遺傳育種工作的寶貴種質(zhì)。栽培大豆是從野生大豆經(jīng)過人工改良馴化和長期定向選擇逐漸積累有益農(nóng)藝性狀演化而成的。雖然栽培大豆和野生大豆的線粒體全基因組已完成測序（Chang?et?al.，2013;Sajjad?et?al.，2018），但關(guān)于兩者的mtDNA編碼基因的密碼子使用模式比較研究尚未見報道。比較研究野生大豆和栽培大豆mtDNA編碼基因的密碼子偏好性，能夠更好地揭示兩個同屬物種的線粒體基因表達系統(tǒng)差異和進化差異。本研究擬以大豆屬的野生大豆和栽培大豆線粒體基因組為研究對象，對其密碼子使用特征進行系統(tǒng)分析，揭示影響其密碼子偏性形成的主要因素，并確定最優(yōu)密碼子。通過比較兩個同屬物種對線粒體編碼序列密碼子使用的差異，以期為大豆在人工馴化進程中線粒體表達系統(tǒng)遺傳變異的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?序列材料

在NCBI數(shù)據(jù)庫檢索一年生野生大豆和栽培大豆的線粒體基因組序列，其GenBank登錄號分別為NC_039768.1和NC_020455.1。分別下載2個物種的線粒體基因組所有編碼序列，剔除重復(fù)的編碼序列以及小于300?bp的編碼序列，并經(jīng)開放閱讀框研判，符合條件的余下編碼序列用于本研究的偏性分析。

1.2?方法

1.2.1中性繪圖分析?分別統(tǒng)計野生大豆和栽培大豆線粒體基因組各CDS在密碼子第1位、第2位和3位的GC含量，以GC3（第3位GC含量）為橫坐標(biāo)，以GC2（第2位GC含量）和GC1（第1位GC含量）的平均值為縱坐標(biāo)（計為GC12）繪制二維散點圖，以分析三聯(lián)體密碼子三個位置堿基組成的相關(guān)性（Sueoka，1988）。若GC12與GC3的相關(guān)性不顯著，則表明密碼子第1位、第2位與第3位堿基使用存在差異，選擇壓力對密碼子偏性影響較大;若GC12與GC3顯著相關(guān)，表明密碼子第1位、第2位與第3位堿基使用無差異，密碼子偏性的形成受突變的影響大。

1.2.2?相對同義密碼子使用度分析?應(yīng)用CodonW軟件計算獲得各編碼基因的有效密碼子數(shù)（Nc值）、密碼子偏愛指數(shù)（codon?bias?index，CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency?of?optimal?codons，F(xiàn)op）。利用CAIcal在線服務(wù)器對大豆線粒體基因組編碼序列的相對同義密碼子使用度（relative?synonymous?codon?usage，RSCU）進行分析（Puigbo?et?al.，2008）。若RSCU=1，表明該密碼子的使用無偏好性;若RSCU>1，表明該密碼子的使用頻率大于同義密碼子使用的平均頻率;若RSCU<1，則表明低于平均頻率。

1.2.3?Nc-plot繪圖分析?以GC3s為橫坐標(biāo)，Nc值為縱坐標(biāo)，作散點圖，以探討堿基組成對密碼子偏好性的影響;以僅由堿基組成決定密碼子偏好性時的理論值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線反映了在突變壓力下的Nc和GC3s的函數(shù)關(guān)系（Wright?et?al.，1990）。理論Nc值計算公式為Nc=2+GC3s+29/[GC3s?2+（1-GC3s）2]。

1.2.4?奇偶偏好分析?PR2（parity?rule?2，PR2）分析，為避免由密碼子第3位堿基的A/T?或T/A?和G/C?或C/G的突變不均衡，僅選擇4種密碼子編碼的氨基酸，即丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、精氨酸和甘氨酸，進行密碼子第3位上4種堿基組成的分析。以每個基因A3/（A3+T3）值作縱坐標(biāo)，G3/（G3+C3）值作橫坐標(biāo)，以平面散點圖展示各基因堿基組成。中心點代表C=G且A=T，由中心點向坐標(biāo)點發(fā)出的矢量則表示偏倚程度和方向（Sueoka，1999）。

1.2.5?最優(yōu)密碼子分析?以CDS的Nc值為偏性標(biāo)準(zhǔn)，將大豆線粒體基因組編碼基因中Nc值居于最低和最高兩極的10%基因分別構(gòu)成高、低表達組，統(tǒng)計兩組的RSCU值。當(dāng)兩組間ΔRSCU（高表達組RSCU值-低表達組RSCU值）大于0.08密碼子定義為高表達密碼子。將整體RSCU?>1的密碼子確定為高頻率密碼子。同時滿足上述兩種條件的密碼子定義為最優(yōu)密碼子（Wang?et?al.，2018）。

2?結(jié)果與分析

2.1?密碼子使用特征

栽培大豆和野生大豆在線粒體基因組編碼區(qū)的堿基組成上基本一致，其總體GC含量分別為44.56%和44.58%。它們的整個線粒體基因組GC含量均為45.03%。栽培大豆和野生大豆的線粒體編碼基因在密碼子三個不同位置的堿基GC含量也有所差異，密碼子第1位堿基的?GC?含量最高，分別為?48.27%、48.31%，第2位分別為?43.76%、43.52%，第3位分別為?41.64%、41.92%，呈現(xiàn)出GC1>GC2>?GC3的趨勢（表1）。這表明兩個物種線粒體編碼基因富含?A、T?堿基。

栽培大豆和野生大豆的Nc與GC3分別呈顯著相關(guān)和極顯著相關(guān)，與GC1和GC2的相關(guān)性均未達顯著水平，說明其線粒體編碼基因密碼子第3位上的堿基組成對密碼子偏性影響較大。線粒體基因組編碼序列的GC1、GC2和GC3，在野生大豆中呈兩兩顯著相關(guān)，表明其密碼子第1位、第2位和第3位的堿基組成相似;而在栽培大豆中GC1與GC2及GC3的相關(guān)性均未達顯著水平，僅GC2和GC3顯著相關(guān)，表明其密碼子第1位與第2位、第3位的堿基組成不同，第2位和第3位的堿基組成相似。在野生大豆中，Nc還與線粒體基因組編碼基因的GC含量（GCcds）及最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）呈極顯著相關(guān)，與CBI呈顯著相關(guān);而在栽培大豆中，Nc與GCcds及Fop均不顯著（表2）。這表明兩種大豆屬植物線粒體基因組密碼子偏性的影響因素有所差異。

2.2?中性繪圖分析

栽培大豆和野生大豆線粒體基因組各基因的中性繪圖分析（圖1）結(jié)果顯示，各基因坐標(biāo)點未沿對角線趨勢分布。栽培大豆線粒體CDS的GC12分布在0.312?5～0.568?0，GC3分布在0.301?6～0.619?0;一年生野生大豆線粒體CDS的GC12含量分布在0.342?3～0.604?5，GC3分布在0.270?0～0.609?5。兩個物種GC12和GC3的相關(guān)系數(shù)分別為0.326和0.329，雙側(cè)檢驗表明其相關(guān)性達極顯著水平;回歸曲線斜率分別為0.1739和0.21。這說明密碼子第1位、第2位與第3位堿基的組成和變異模式相似，突變對基因密碼子偏好性的形成有重要影響，其他因素（例如自然選擇）可能對密碼子偏好性形成的影響較小。栽培大豆線粒體密碼子偏性的形成受選擇的影響高于野生大豆，這可能是大豆長期人工栽培馴化的結(jié)果。

2.3?Nc與GC3s?的關(guān)聯(lián)分析

以GC3s為橫坐標(biāo)，各基因Nc值為縱坐標(biāo)繪制Nc-plot曲線，以進一步判斷突變或選擇等因素對大豆線粒體基因組編碼序列密碼子偏好性形成的影響。根據(jù)（Nc預(yù)期-Nc實際）/Nc預(yù)期的公式計算Nc比值（表3）。栽培大豆和野生大豆Nc比值分布在-0.1～0.1?區(qū)間的線粒體基因占70%以上，這些基因?qū)?yīng)的散點集中分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，其Nc實際值和預(yù)期值差異較小，表明這些線粒體基因的密碼子偏好性的形成主要受突變因素的影響;其余基因散點偏離于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方（圖2），Nc實際值和預(yù)期值之間相差較大，表明這些基因的密碼子偏好形成更多地受選擇的影響。

2.4?PR2-plot分析

采用PR2-plot方法分析栽培大豆和野生大豆線粒體基因組CDS的四種同義密碼子第3位堿基組成（圖3）。圖3結(jié)果表明，散點并不是均勻地分布于PR2平面圖中的四個區(qū)域內(nèi)，50%以上散點位于平面圖的左下區(qū)域，表明在同義密碼子第3位堿基的使用頻率上，A低于T，G低于C。若密碼子使用偏好性僅由突變影響，則同義密碼子第3位4種堿基的使用頻率理論值相等，即A=T，C=G。A?和?T?以及?G?和?C?的使用頻率不均衡性，表明兩種大豆線粒體基因組密碼子的使用偏好性由突變和選擇等因素共同影響。

2.5?最優(yōu)密碼子分析

對栽培大豆和一年生野生大豆線粒體基因組各編碼序列的Nc值進行排序，分別從兩極各選出8?個基因構(gòu)建高、低表達組。按組計算各基因同義密碼子的RSCU值，并根據(jù)對高表達密碼子和高頻率密碼子的定義，最終確定了栽培大豆和野生大豆TTT、TTA、CTT、ATT、GTA、TCC、CCT、ACT、ACA、GCT、CAA、AAT、AAA、GAT、GAA、CGT、AGA、GGT18個共有的最優(yōu)密碼子。此外，確定了CAT和CGA為栽培大豆的最優(yōu)密碼子;GTT、TGT和GGA為野生大豆的最優(yōu)密碼子。以上最優(yōu)密碼子中以A結(jié)尾有9個，以T結(jié)尾的有13個，以C結(jié)尾的有1個，沒有以G結(jié)尾的最優(yōu)密碼子。暗示了大豆線粒體基因組偏好于使用A或T結(jié)尾的密碼子（表4）。

3?討論與結(jié)論

根據(jù)內(nèi)共生理論，線粒體由ɑ-蛋白質(zhì)細菌祖先進化（Roger?et?al.，2017）。作為半自主型的細胞器，線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其有自身的遺傳表達系統(tǒng)，但大多數(shù)定位于線粒體的功能蛋白（>95%）是由核基因編碼的（Giegé?et?al.，2005）。由于其含有相對獨立的細胞質(zhì)遺傳信息，故線粒體基因組亦在揭示物種間親緣關(guān)系和物種進化等方面具有重要價值。通過比較核基因和線粒體基因在密碼子使用模式上的差異，可以預(yù)測真核生物核糖體在細胞內(nèi)的定位。此外，研究線粒體密碼子的使用特征可以更好地了解線粒體基因組的進化過程及主要影響因素。

同義密碼子的使用偏好性是物種長期演化的結(jié)果，形成這種偏好性的主要動力是自然選擇和突變（Duret，2002）。突變和選擇等多重因素共同影響了大豆線粒體基因密碼子使用偏好性的形成。比較栽培大豆和野生大豆的ENC-plot、中性繪圖和PR2-plot等分析，結(jié)果暗示了它們具有相似的密碼子使用模式，這是因為兩個物種在進化和親緣關(guān)系上較近（Grantham?et?al.，1980）。但兩個物種在密碼子使用模式上也存在一定的差異。按同一標(biāo)準(zhǔn)判斷它們有相同的最優(yōu)密碼子，也有各自不同的最優(yōu)密碼子。

本研究確認(rèn)了栽培大豆的20個和野生大豆的21個最優(yōu)密碼子。其中18個最優(yōu)密碼子為兩個物種共有，且多以A或T堿基結(jié)尾。栽培大豆和野生大豆的線粒體編碼基因在密碼子第3位的GC含量分別為41.64%、?41.92%。這與許多高等植物的葉綠體基因組第3位密碼子偏好使用A或T堿基相似（Zhou?et?al.，2008;尚明照等，2011;傅建敏等，2017;原曉龍等，2019）。而與線粒體基因不同，大豆的核基因最優(yōu)密碼子被確定為UCC和GCC（張樂等，2011），暗示了大豆的核基因和線粒體基因在密碼子使用偏性上的差異。按照同樣的最優(yōu)密碼子計算方法，經(jīng)比較分析，普通野生稻和栽培大豆共有的線粒體基因組最優(yōu)密碼子為15個，普通野生稻和野生大豆共有的線粒體基因組最優(yōu)密碼子為16個（金剛等，2019）。推測這并非偶然，而是植物線粒體基因組表達系統(tǒng)在進化中保守性的體現(xiàn)。尚需對其他高等植物的線粒體密碼子進行歸納研究后得出結(jié)論。而非最佳密碼子可能更多地與其二級結(jié)構(gòu)相關(guān)（Chaney?et?al.，2017）。按照現(xiàn)代的植物細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic?male?sterility，CMS）發(fā)生理論，細胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生與線粒體基因組的重組變異有關(guān)（Tang?et?al.，2017）。普通野生稻線粒體基因組中細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因CW-orf307與其線粒體基因組的密碼子偏好性有所不同，TCT、CCT、ACA、TTT和CAT等在線粒體基因組中被認(rèn)定的最優(yōu)密碼子在CW-orf307基因中的使用頻率并不高，暗示了CW-orf307獨特的起源（金剛等，2019）。但野生大豆中的相關(guān)情況尚需對其線粒體基因組中的細胞質(zhì)雄性不育基因進行鑒定并分析后才能確定。本研究通過分析比較野生大豆和栽培大豆線粒體基因組編碼基因的密碼子使用特征，將有助于進一步加深對大豆屬植物的線粒體基因表達系統(tǒng)進化的理解。

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（責(zé)任編輯?何永艷）