劉慶艾，馬恒，馬耀宏，楊俊慧，史建國

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250014）

我國是世界第二大玉米生產(chǎn)國，其加工產(chǎn)品涉及食品、醫(yī)療、餐飲、造紙、紡織等多個領(lǐng)域，年產(chǎn)值達(dá)1萬億以上，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位[1-3]。目前玉米淀粉生產(chǎn)主要采用濕磨技術(shù)，浸泡是第一道也是最重要的一道工序，浸泡質(zhì)量直接影響后序工序的正常生產(chǎn)，影響淀粉的產(chǎn)量和質(zhì)量[4-5]。傳統(tǒng)的玉米浸泡工藝普遍采用亞硫酸溶液進(jìn)行浸泡，存在生產(chǎn)周期長、成本高、效率低、能耗高等缺點(diǎn)[6-7]，同時釋放的SO2氣體污染環(huán)境，還會在一定程度上造成設(shè)備腐蝕、地下水污染、產(chǎn)品中亞硫酸殘留等問題[8-9]。Ruan曾用O3代替亞硫酸加入到玉米浸泡液中，取得了良好的浸泡效果[10]，但是該研究需要增加O3發(fā)生裝置，工藝較為復(fù)雜，因此本研究選用同樣具有氧化作用的H2O2作為浸泡劑。乳酸在玉米浸泡液中具有重要作用，研究表明，乳酸能夠促進(jìn)玉米蛋白質(zhì)軟化和膨脹，保持溶液中的鎂離子和鈣離子，有利于減少不溶性物質(zhì)的沉積[11-13]。乳酸和亞硫酸聯(lián)合作用，可增強(qiáng)對玉米的浸泡效果，加速水分進(jìn)入玉米籽粒，縮短浸泡時間，促進(jìn)玉米中淀粉和蛋白質(zhì)之間的分離，從而提高玉米淀粉的產(chǎn)率和質(zhì)量[14]。

本研究利用H2O2與乳酸協(xié)同浸泡玉米，并通過正交試驗(yàn)對其浸泡工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)浸泡條件。H2O2分解后的副產(chǎn)物為氧氣和水，不會造成環(huán)境污染，解決了傳統(tǒng)浸泡工藝中亞硫酸帶來的環(huán)境污染問題。同時，利用Miseq高通量測序技術(shù)分析玉米浸泡過程中細(xì)菌群落的變化[15-17]，了解浸泡過程中細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，為玉米浸泡過程中微生物的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米：山東濟(jì)寧菱花集團(tuán)有限公司（含水量12.03%）；H2O2、乳酸：國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；DNA提取試劑盒：Omega Soil DNA Kit（50）；其他試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LE204E電子天平、S220多參數(shù)測試儀：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；303A電熱恒溫培養(yǎng)箱：南通宏大實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；JYL-C23九陽料理機(jī)：九陽股份有限公司；LXJ64-01離心機(jī)：河北省吳橋電機(jī)廠；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；SIGMA 1-14小型臺式高速離心機(jī)：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)浸泡工藝（實(shí)驗(yàn)室模擬逆流法浸泡）

在實(shí)驗(yàn)室中使用8個5L大燒杯（1#-8#）模擬實(shí)際生產(chǎn)過程中的8個玉米浸泡罐，在新裝罐玉米中加老漿，浸泡時間長的玉米加新酸，罐與罐之間每10 h進(jìn)行一次循環(huán)，浸泡70 h后進(jìn)行淀粉分離并計(jì)算淀粉得率。

1.3.2 H2O2玉米浸泡工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用乳酸與H2O2協(xié)同浸泡玉米，考察初始乳酸濃度、乳酸作用時間、H2O2濃度和H2O2作用時間4個因素對淀粉得率的影響。

1.3.2.1 乳酸濃度

稱?。?0±0.1）g玉米，浸泡溫度為（50±2）℃，分別使用乳酸濃度為 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的浸泡液浸泡玉米，作用時間16 h，粉碎；然后在浸泡液中添加濃度為2%的H2O2溶液，作用時間22 h，浸泡完畢進(jìn)行淀粉分離并計(jì)算淀粉得率。

1.3.2.2 乳酸作用時間

稱取（50±0.1）g玉米，浸泡溫度為（50±2）℃，使用濃度為 0.6%的乳酸分別浸泡玉米 6、8、10、12、14、16、18、20 h，粉碎；然后在浸泡液中添加濃度為2%的H2O2溶液，作用時間22 h，浸泡完畢進(jìn)行淀粉分離并計(jì)算淀粉得率。

1.3.2.3 H2O2濃度

稱?。?0±0.1）g玉米，浸泡溫度為（50±2）℃，使用濃度為0.6%的乳酸浸泡玉米，作用時間16 h，粉碎；然后分別在浸泡液中添加濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的H2O2溶液，作用時間22h，浸泡完畢進(jìn)行淀粉分離并計(jì)算淀粉得率。

1.3.2.4 H2O2作用時間

稱取（50±0.1）g玉米，浸泡溫度為（50±2）℃，使用濃度為0.6%的乳酸浸泡玉米，作用時間16 h，粉碎；然后在浸泡液中添加濃度為2%的H2O2溶液，作用時間分別為 12、14、16、18、20、22、24、26 h，浸泡完畢進(jìn)行淀粉分離并計(jì)算淀粉得率。每個試驗(yàn)做3個平行試驗(yàn)。

用料理機(jī)細(xì)粉碎浸泡后的玉米，所得玉米漿依次過50、250目篩，除去胚、種皮、麩質(zhì)等。濾液4℃靜置過夜，3 000 r/min離心去除蛋白質(zhì)后，烘干至恒重，稱重并計(jì)算淀粉得率。

式中：Y 為淀粉得率，%；W2為淀粉質(zhì)量，g；W1為玉米干重，g。

1.3.3 H2O2玉米浸泡工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對初始乳酸濃度、乳酸作用時間、H2O2濃度、H2O2作用時間4個因素作3個水平的正交試驗(yàn)L9（34）。以淀粉得率為評價指標(biāo)，研究H2O2與乳酸協(xié)同浸泡玉米的最優(yōu)工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The orthogonal experiment factor level table

1.3.4 Miseq高通量測序技術(shù)分析浸泡過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化

1.3.4.1 總DNA的提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增

在最優(yōu)條件下利用H2O2與乳酸協(xié)同浸泡玉米，在浸泡時間為 5.5、11、16、21.5、27、32.5、38 h 時，取 100 mL玉米浸泡液，抽濾得總DNA樣品，分別編號y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7。利用土壤 DNA 提取試劑盒按照操作說明進(jìn)行DNA的提取[17]。每個試驗(yàn)做3個平行試驗(yàn)。

1.3.4.2 PCR產(chǎn)物純化及定量

以樣品的基因組總DNA為模板，乳酸菌16S rDNA 引物為 338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和 806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′為引物。PCR試驗(yàn)采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反應(yīng)體系：

5 ×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orwardPrimer（5μmol/L）0.8μL，ReversePrimer（5μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase0.4 μL，牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）0.2 μL，Template DNA10 ng，補(bǔ) ddH2O 至20 μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：

1）1×（3 min 95 ℃）

2）循環(huán)數(shù)×（30 s 95 ℃；30 s 55 ℃；45 s at 72 ℃）

3）10 min 72℃，直到停止。

1.3.4.3 高通量測序

PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、克隆后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.3.4.4 QIIME軟件數(shù)據(jù)分析

使用QIIME軟件來定量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量[18-20]。得到的序列進(jìn)行分類單位（operational taxonomic unit，OTU）聚類分析，對所有序列進(jìn)行OTU劃分，對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，之后進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個水平（門，綱，目，科，屬，種）統(tǒng)計(jì)每個樣品的群落組成。對樣品的OTU進(jìn)行細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成、Alpha多樣性分析和環(huán)境因子典范對應(yīng)分析（canonical corresponat encearalysis，CCA）相關(guān)分析，通過比對和統(tǒng)計(jì)分析得到浸泡過程中細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始乳酸濃度對淀粉得率的影響

淀粉得率隨初始乳酸濃度變化曲線如圖1所示。

圖1 淀粉得率隨初始乳酸濃度變化曲線Fig.1 The curve of starch yield changing with the initial concentration of lactic acid

由圖1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，玉米淀粉得率隨初始乳酸濃度的增加而增加，當(dāng)初始乳酸濃度達(dá)到0.6%以上，玉米淀粉得率隨初始乳酸濃度的增加反而下降。這可能是因?yàn)?，乳酸在初始作用階段可以促進(jìn)玉米表皮軟化，蛋白質(zhì)疏松，保持溶液中的Ca2+/Mg2+等主要離子濃度，加速浸泡水進(jìn)入玉米顆粒內(nèi)部并與內(nèi)部結(jié)構(gòu)作用；但過高濃度的乳酸在提高蛋白質(zhì)溶解度的同時會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，與淀粉顆粒的分離更加困難。因此選擇0.5%、0.6%、0.7%作為正交試驗(yàn)的乳酸濃度因素水平。

2.1.2 乳酸作用時間對淀粉得率的影響

乳酸作用時間對玉米淀粉得率的影響如圖2所示。

圖2 淀粉得率隨乳酸浸泡時間變化曲線Fig.2 The curve of starch yield changing with the steeping time of lactic acid

由圖2可知，16 h內(nèi)淀粉得率隨乳酸作用時間的延長不斷提高，16 h后趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)槿樗嶙饔脮r間過長會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使得淀粉和蛋白質(zhì)的分離更加困難，因而淀粉得率降低。綜合節(jié)約能源及提高淀粉得率雙方面的考慮，選擇14、16、18 h作為正交試驗(yàn)的乳酸浸泡時間因素水平。

2.1.3 H2O2濃度對淀粉得率的影響

H2O2濃度對玉米淀粉得率的影響如圖3所示。

圖3 淀粉得率隨加H2O2量變化曲線Fig.3 The curve of starch yield changing with the content of H2O2

由圖3可以看出，淀粉得率隨著H2O2濃度的增加而不斷提高，當(dāng)H2O2濃度增加至2%之后，玉米淀粉得率趨于穩(wěn)定。因此，選擇2%、2.5%、3%的H2O2量作為正交試驗(yàn)的H2O2濃度因素水平。

2.1.4 H2O2作用時間對淀粉得率的影響

H2O2作用時間對玉米淀粉得率的影響如圖4所示。

由圖4可知，淀粉得率隨H2O2作用時間的延長而不斷提高，當(dāng)H2O2作用時間延長至24 h后，玉米淀粉得率趨于平穩(wěn)，原因可能是H2O2破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)的反應(yīng)趨于平衡。因此，選擇18、20、22 h作為正交試驗(yàn)的H2O2作用時間因素水平。

圖4 淀粉得率隨H2O2作用時間變化曲線Fig.4 The curve of starch yield changing with the action time of H2O2

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

由表2可知，根據(jù)極差值R可知，影響H2O2玉米浸泡效果的因素順序?yàn)椋篊＞D＞B＞A，其中H2O2濃度對浸泡效果的影響最大，H2O2作用時間次之，影響最小的是乳酸浸泡時間。由正交試驗(yàn)結(jié)果確定H2O2玉米浸泡工藝的最佳浸泡條件為：A2B1C3D3，即乳酸濃度0.6%、乳酸作用時間16 h、H2O2濃度3%、H2O2作用時間22 h。在最優(yōu)浸泡條件下，淀粉得率由傳統(tǒng)浸泡工藝的56.02%提高到68.53%，浸泡時間縮短至38 h。

2.3 浸泡過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化

應(yīng)用MiSeq測序平臺對不同浸泡時間取得的樣品進(jìn)行16SrDNA基因測序，共獲得56個細(xì)菌OUT，分屬 于細(xì)菌的6個門、38個屬。如圖5所示。

圖5 不同浸泡時間的玉米浸泡液細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成Circos圖Fig.5 Microbial community structure by Circos of 16S rDNA genes in different time of corn steeping process

由Circos圖分析可知，玉米浸泡過程中的主要菌種分別為：鳥乳桿菌（Lactobacillus-aviarius）；G-芽孢桿菌（unclassified-g-Bacillus）；乳酸片球菌（Pediococcus-acidilactici）；G-乳桿菌（unclassified-g-Lactobacillus）；人陰道乳桿菌（Lactobacillus-coleohominis）。

對不同浸泡時間的樣品進(jìn)行群落組成分析和Alpha多樣性分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6-A群落組成分析結(jié)果表明，浸泡前期，OTU10（芽孢桿菌）與OTU31（片球菌）在該樣品序列組成中占主要部分，隨時浸泡時間延長OTU37（乳桿菌）序列逐漸增加并成為優(yōu)勢菌種序列，而浸泡末期OTU10（芽孢桿菌）與OTU31（片球菌）又成為優(yōu)勢菌種序列。圖6-B Alpha多樣性分析結(jié)果表明，初期浸泡液中細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成較為豐富，浸泡5.5 h時OUT水平明顯高于其他時間段，隨浸泡時間的延長物種豐富度逐漸降低。造成該結(jié)果的主要原因是，初期浸泡液中細(xì)菌種類復(fù)雜，對玉米浸泡起主要作用的乳酸桿菌數(shù)量較少，隨浸泡過程的進(jìn)行，浸泡液中的溫度、pH值等環(huán)境因素愈加適合乳酸桿菌的生長，使其成為優(yōu)勢菌種。

2.4 浸泡過程中群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境相關(guān)性分析

玉米浸泡過程中的細(xì)菌群落與環(huán)境因子的CCA相關(guān)分析如圖7所示。

分析結(jié)果表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與浸泡溫度、pH值、葡萄糖、乳酸含量等因素相關(guān)系數(shù)較高，這與浸泡條件變化有關(guān)。乳桿菌生長代謝產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致浸泡環(huán)境中pH的變化，浸泡初始階段與結(jié)束階段OTU10（芽孢桿菌）與OTU31（片球菌）生長受pH值影響較大，酸性環(huán)境對菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；浸泡中期，優(yōu)勢菌種OTU37（乳桿菌）受酸性環(huán)境影響不明顯，浸泡環(huán)境溫度輕微浮動可能對細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響；乳酸、葡萄糖的含量變化代表了浸泡液中主要作用細(xì)菌代謝產(chǎn)物及生長需求底物的變化，故乳酸、葡萄糖的含量變化對細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變化相關(guān)系數(shù)更高，存在差異顯著性。在考察的4種環(huán)境因子中，除溫度與其他3種因素呈負(fù)相關(guān)外，其他3種因素間均為正相關(guān)。

圖6 玉米浸泡不同浸泡時間細(xì)菌結(jié)構(gòu)群落組成分析（A）與Alpha多樣性分析圖（B）Fig.6 Microbial community structure by Community barplot analysis（A）and Alpha diversity estimators（B）of 16S rDNA genes in different time of corn steeping process

圖7 玉米浸泡不同浸泡時間細(xì)菌結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的CCA相關(guān)性分析Fig.7 Microbial community structure by RDA on OUT level analysis of 16S rDNA genes in different time of corn steeping process

3 結(jié)論

本研究利用H2O2與乳酸協(xié)同浸泡玉米，通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)浸泡條件，并利用Miseq高通量測序技術(shù)對浸泡過程中的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，從而達(dá)到優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高浸泡效率的目的。對影響玉米浸泡效果的4個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以淀粉得率為評價指標(biāo)得出最優(yōu)浸泡條件。正交試驗(yàn)表明，玉米浸泡的最優(yōu)條件為初始乳酸含量0.6%、乳酸作用時間16 h、H2O2濃度3%、H2O2作用時間22 h，在最優(yōu)條件下，淀粉得率由傳統(tǒng)工藝的56.02%提高到68.53%，浸泡時間縮短32 h。利用Miseq測序平臺對不同時間段的浸泡液細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，共獲得51個細(xì)菌OUT。浸泡初期細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成較為豐富，片球菌屬（Pediococcus）與桿菌屬（Bacillus）在浸泡過程中起主要作用；隨著浸泡時間的延長，乳酸桿菌（Lactobacillaceae）數(shù)量增加、作用能力增強(qiáng)，成為優(yōu)勢菌種并伴隨OTU水平的降低；而浸泡末期隨著浸泡環(huán)境的變化（Lactobacillaceae）進(jìn)入衰亡期，其他細(xì)菌數(shù)量明顯增加，片球菌屬（Pediococcus）與桿菌屬（Bacillus）成為優(yōu)勢菌種。分析浸泡液中細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)浸泡過程中對菌落結(jié)構(gòu)差異產(chǎn)生影響的環(huán)境因素依次為乳酸含量、葡萄糖含量、浸泡液pH值、浸泡溫度。

新型玉米浸泡技術(shù)可以提高玉米淀粉得率，縮短浸泡時間，減少環(huán)境污染，解決了傳統(tǒng)浸泡工藝中亞硫酸帶來的環(huán)境污染問題。不同浸泡時間的細(xì)菌結(jié)構(gòu)中特定的細(xì)菌種類不同，利用Miseq高通量測序技術(shù)分析該浸泡條件下細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，可以為浸泡過程中微生物調(diào)控提供基礎(chǔ)，從而達(dá)到優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高浸泡效率的目的。