李偉，李霞，徐杰，白小崗，白婷

糖尿病是由多種病因引發(fā)的代謝性疾病，其特點(diǎn)為慢性高血糖，并伴有胰島素分泌或作用缺失，誘發(fā)蛋白質(zhì)、糖和脂肪代謝紊亂[1]。胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能障礙是2型糖尿病的病理基礎(chǔ)[2]。微小RNA(miRNA)在2型糖尿病中可參與胰島細(xì)胞的發(fā)育、糖代謝及并發(fā)癥等過(guò)程。已有報(bào)道稱(chēng)，miRNA在胰島素主要效應(yīng)器官如脂肪細(xì)胞、肝、骨骼肌等中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致胰島素抵抗[3]。微小RNA-181a(microRNA-181a，miR-181a)可調(diào)節(jié)功能蛋白的表達(dá)及信號(hào)通路，參與細(xì)胞多項(xiàng)生理活動(dòng)。研究表明，miR-181a在多種疾病及腫瘤中異常表達(dá)，參與疾病或腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。微小RNA-9(microRNA-9，miR-9)在多種人類(lèi)疾病中表達(dá)異常，如miR-9在肝癌患者血清外泌體中表達(dá)水平低于正常供體[5]。miR-181a、miR-9在2型糖尿病中對(duì)胰島素抵抗的作用少見(jiàn)報(bào)道，現(xiàn)分析2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miR-181a、miR-9表達(dá)及其與胰島素抵抗的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年12月—2019年12月延安大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科診治2型糖尿病患者97例作為觀察組，其中男50例，女47例，平均年齡(46.73±10.25)歲；平均體質(zhì)指數(shù)(BMI)(24.78±3.23)kg/m2；平均收縮壓(127.82±12.13)mmHg，平均舒張壓(78.24±10.63)mmHg；有糖尿病家族病史32例，高血壓21例，飲酒26例，有吸煙史38例。選取同一時(shí)間在醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康者93例作為健康對(duì)照組，其中男47例，女46例，平均年齡(45.36±10.57)歲，平均BMI(23.54±2.65)kg/m2；平均收縮壓(125.36±11.78)mmHg，平均舒張壓(77.81±10.32)mmHg；飲酒23例，有吸煙史34例。2組受試者的性別、年齡、收縮壓、舒張壓、飲酒及有吸煙史者比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，觀察組BMI高于健康對(duì)照組(P<0.05)。本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者及家屬知情且簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2017年版)》中關(guān)于2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②病程在1年以?xún)?nèi)；③未接受降糖治療者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有惡性腫瘤者；②近期外傷者；③合并肝、腎等疾病者；④急慢性感染性疾病者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 患者入院翌日清晨、體檢者當(dāng)日取其空腹外周靜脈血7 ml，保存于真空抗凝采血管中；其中2 ml血液離心得血漿存于-80℃冰箱，檢測(cè)生化指標(biāo)，另外5 ml血液用于提取PBMC。并采集所有受試對(duì)象餐后2 h的靜脈血2 ml,用于檢測(cè)餐后2小時(shí)血糖(2hPG)。

1.3.1 空腹胰島素(FINS)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：采用微粒子化學(xué)發(fā)光法測(cè)定FINS， 采用穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算HOMA-IR值，計(jì)算公式：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.3.2 空腹血糖(FPG)、2 hPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)定：采用全自動(dòng)生化分析儀(BS-360E型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定FPG、2 hPG，采用多功能全定量金標(biāo)檢測(cè)儀(NO202M型，濟(jì)南奧諾生物工程有限公司)檢測(cè)HbA1c。

1.3.3 PBMC制備：上述血液5 ml加入等量PBS緩沖液[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]，混合均勻后加入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心收集白膜層細(xì)胞，移至新離心管中，PBS重懸洗滌，再以Ficoll 密度梯度離心法離心留取管底部的細(xì)胞團(tuán)塊即為PBMC。將PBMC加入TRIzol(日本TaKaRa公司) 1 ml進(jìn)行裂解，-80℃保存，用于提取RNA。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定miR-181a、miR-9表達(dá)檢測(cè)：從-80℃取出PBMC樣本，嚴(yán)格按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)RNA純度及完整度；嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化有限公司)說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20℃保存。qRT-PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系20 μl)：cDNA模板2 μl， 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，H2O 6 μl，各個(gè)樣本設(shè)置3次平行。根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的上下游引物，均以U6為內(nèi)參，序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃ 30 s,95℃ 10 s、60℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)，在qRT-PCR儀[型號(hào)：MiniAmp，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]上進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-181a、miR-9的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-181a、miR-9及內(nèi)參基因U6的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 FINS及HOMA-IR水平比較 觀察組FINS及HOMA-IR水平[(12.78±3.86)μIU/L、4.85±2.37]均明顯高于健康對(duì)照組[(5.43±0.99) μIU/L、1.23±0.32]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.808、14.601，P均=0.000)。

2.2 2組FPG、2 hPG、HbA1c水平比較 觀察組FPG、2hPG、HbA1c水平均明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組血糖、HbA1c比較

2.3 PBMC中miR-181a、miR-9表達(dá)比較 觀察組PBMC中miR-181a、miR-9的表達(dá)量(2.07±0.65、4.25±1.06)均明顯高于健康對(duì)照組(1.24±0.41、1.37±0.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.476、24.113，P均=0.000)。

2.4 HOMA-IR 與PBMC中miR-181a、miR-9表達(dá)的相關(guān)性 2型糖尿病患者PBMC中HOMA-IR與miR-181a、miR-9表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.413、0.464，P均=0.000)。

2.5 影響2型糖尿病患者HOMA-IR的多因素分析 將2型糖尿病患者HOMA-IR值作為因變量，以BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平及miR-181a、miR-9表達(dá)作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，BMI、2 hPG、HbA1c、miR-181a及miR-9表達(dá)均是2型糖尿病患者發(fā)生胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表4 影響2型糖尿病患者HOMA-IR的多因素分析

3 討 論

糖尿病與心血管疾病、腫瘤并列為三大非傳染性慢性疾病，患病人數(shù)逐年攀升。糖尿病可分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊類(lèi)型糖尿病，其中2型糖尿病最為常見(jiàn)[7]。2型糖尿病具有隱匿性，多數(shù)由于出現(xiàn)并發(fā)癥被確診，病程較長(zhǎng)，嚴(yán)重者可致殘或死亡，對(duì)患者生活質(zhì)量帶來(lái)極大影響[8]。2型糖尿病是慢性進(jìn)展性疾病，隨著病程進(jìn)展，胰島β細(xì)胞功能減退，補(bǔ)充胰島素是控制2型糖尿病患者高血糖的有效手段[9]。本研究分析2組受試者的一般資料，發(fā)現(xiàn)觀察組的BMI、FPG、2hPG、HbA1c水平均明顯高于健康對(duì)照組，提示2型糖尿病患者的多項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)異常，影響患者的多種功能。胰島素抵抗是胰島素作用的組織、靶器官對(duì)胰島素的反應(yīng)性降低或喪失而造成的臨床病理表現(xiàn)，由多種疾病共同引發(fā)，但發(fā)病機(jī)制尚不明確[10]。胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，容易誘發(fā)糖脂代謝紊亂；同時(shí)也存在于肥胖、高血壓、高血脂等代謝疾病中影響疾病進(jìn)程[11-12]。胰島素抵抗主要發(fā)生在肝臟及外周組織(肌肉、脂肪)中，可表現(xiàn)為胰島素抑制肝糖原輸出的能力減弱或骨骼肌、脂肪組織儲(chǔ)存利用葡萄糖發(fā)生障礙[13-14]。在2型糖尿病患者中，約80%患者伴隨胰島素抵抗，因此臨床上對(duì)于2型糖尿病的治療集中于控制血糖和改善胰島素抵抗兩個(gè)方面[15-16]。比較2組FINS及HOMA-IR水平，發(fā)現(xiàn)觀察組FINS及HOMA-IR水平均明顯高于健康對(duì)照組，提示2型糖尿病患者存在胰島素抵抗現(xiàn)象。

miRNA是由20～24個(gè)核苷酸組成的單鏈RNA，對(duì)大多數(shù)的編碼基因有調(diào)控作用，可作為多種疾病的生物標(biāo)志物[17]。miRNA可調(diào)控多種內(nèi)源性因子的合成和釋放，從而影響機(jī)體內(nèi)葡萄糖的攝取、儲(chǔ)存及利用等過(guò)程，在2型糖尿病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[18]。miR-181a為 miR-181家族成員，位于人染色體1q32.1處，其5’端存在一段非常保守序列。miR-181a在機(jī)體能量代謝異常組織中表達(dá)上調(diào)，在代謝疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[19]。Lozano-Bartolomé等[20]研究表明，miR-181a在糖尿病患者的脂肪組織中異常表達(dá)，改變患者對(duì)胰島素的敏感性，其過(guò)表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗。本研究結(jié)果中觀察組miR-181a表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，提示miR-181a參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展并呈高表達(dá)，猜測(cè)miR-181a參與機(jī)體能量代謝機(jī)制，其高表達(dá)或與糖尿病誘發(fā)脂肪代謝紊亂有關(guān)；由于糖尿病患者長(zhǎng)期處于代謝失調(diào)狀態(tài)，體內(nèi)炎性反應(yīng)較高或可誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生胰島素抵抗，miR-181a高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素敏感性抑制機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

miR-9位于人15號(hào)染色體處，可調(diào)節(jié)人體內(nèi)血糖水平。Guo等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-9在高脂飲食組小鼠血清中呈高表達(dá)，miR-9及其靶基因OC-2可影響胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)對(duì)胰島β細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能，進(jìn)而影響胰島素基因表達(dá)及胰島素分泌。Jafarian等[22]認(rèn)為沉默miR-9會(huì)增加胰島素產(chǎn)生細(xì)胞中的OC-2蛋白，抗miR-9處理對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、葡萄糖調(diào)節(jié)方式以及胰島素分泌有協(xié)同作用，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)抗-miR-9生成胰島素生產(chǎn)細(xì)胞。本研究結(jié)果中觀察組miR-9表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，提示miR-9參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展并呈高表達(dá)，研究猜測(cè)miR-9可通過(guò)調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞影響胰島素分泌，同時(shí)抗miR-9處理可能促進(jìn)胰島素分泌，而2型糖尿病患者胰島素分泌失常，猜測(cè)miR-9或與胰島素生產(chǎn)細(xì)胞相關(guān)。

Pearson法分析結(jié)果顯示，2型糖尿病患者HOMA-IR與PBMC中miR-181a表達(dá)及miR-9表達(dá)均呈正相關(guān)，提示miR-181a表達(dá)及miR-9表達(dá)可參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，兩者間可能存在某種共同作用機(jī)制或靶標(biāo)調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素抵抗情況。對(duì)影響2型糖尿病患者HOMA-IR的因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BMI、2hPG、HbA1c、miR-181a及miR-9表達(dá)均是2型糖尿病患者胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素，提示下調(diào)miR-181a表達(dá)及miR-9表達(dá)可能會(huì)降低2型糖尿病發(fā)生胰島素抵抗的幾率。

綜上所述，miR-181a、miR-9在2型糖尿病患者PBMC中表達(dá)上調(diào)，且二者均與HOMA-IR呈正相關(guān)，表明二者可能參與胰島素抵抗的發(fā)展進(jìn)程。但由于本研究樣本量少，結(jié)果可能具有局限性，miR-181a、miR-9對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制及其在臨床中的應(yīng)用價(jià)值，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李偉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；李霞：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；徐杰：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；白小崗：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；白婷：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)