洪豆，阿麗雅，江宇峰，朱玲麗，吳淑清*

(1.長(zhǎng)春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華 321031)

紫色馬鈴薯又名黑土豆，富含大量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外，還富含花青素[1]，花青素具有清除自由基、抗癌及抑菌等生理活性功能[2-4]。紫色馬鈴薯花青素屬于天然色素，其在食品、醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域均有應(yīng)用[5]。因此，紫色馬鈴薯將成為未來(lái)重要的糧食作物和食品、醫(yī)藥原材料，必將具有廣闊的發(fā)展前景[6]。

目前，紫色馬鈴薯花青素的提取主要以溶劑法和超聲提取法為主[7,8]，而采用酶法-超聲聯(lián)合技術(shù)提取紫色馬鈴薯花青素的研究鮮有報(bào)道。由于紫色馬鈴薯含有大量的纖維素[9]，利用纖維素酶可將其纖維素水解，有效地破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，加速花青素的溶出，從而達(dá)到提高提取率的目的[10]。超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用能擊破細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加快體系的傳質(zhì)和傳熱速度，加速有效成分的擴(kuò)散和浸出[11]。綜上，本試驗(yàn)采用酶法-超聲聯(lián)合技術(shù)提取紫色馬鈴薯花青素，并對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為此類花青素的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色馬鈴薯：市售；纖維素酶：酶活≥50 U/mg，上海橋星貿(mào)易有限公司；鹽酸、乙醇：分析純，上海研生生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Christ ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；BH1200R超速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ2200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花青素提取

將紫色馬鈴薯洗凈，將表皮水分用濾紙拭干后切成1 cm的薄片后，快速地于-20 ℃下預(yù)凍24 h。24 h后真空冷凍干燥，粉粹過(guò)80目篩得到紫色馬鈴薯粉，置于密閉容器中備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g紫色馬鈴薯粉置于250 mL錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的HCl-C2H5OH溶液(酸醇比為1∶1)和纖維素酶，于200 W超聲提取，然后以7000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液。定容后測(cè)定花青素提取液的吸光度，計(jì)算花青素含量。

1.3.2 花青素含量計(jì)算

采用pH示差法對(duì)提取后的花青素進(jìn)行定量分析[12]。在試驗(yàn)中，每個(gè)樣本進(jìn)行3次吸光值的測(cè)定，得出的數(shù)據(jù)為9次測(cè)定的平均值。根據(jù)pH示差法，按下式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A為吸光值，A=(A530 nm-A700 nm)pH 1.0- (A530 nm-A700 nm)pH 4.5；MW為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；ε為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)26900 L/(mol·cm)；L為光程，1 cm；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.3 工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將料液比、酶添加量、超聲時(shí)間、超聲溫度分別設(shè)為單因素，再分別改變單一因素用量，其他條件不變。以花青素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)確定各因素的最適范圍。單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of single factor experiments

續(xù) 表

1.3.3.2 工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以花青素含量(Y)作為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定紫色馬鈴薯花青素最優(yōu)的提取工藝，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 2 Factors and levels of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)花青素提取的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，花青素含量呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶30 (g/mL)時(shí)，花青素含量達(dá)到最高值。隨著溶液量的增加，提取液和紫色馬鈴薯粉末之間的接觸面積增大，這更利于纖維素酶對(duì)紫色馬鈴薯細(xì)胞壁纖維素的降解，使得細(xì)胞迅速破裂，加快花青素的溶出[13]。但是隨著料液比的不斷增加，提取液中纖維素酶的濃度隨之減小，酶解反應(yīng)速率降低。因此，選擇1∶30 (g/mL)作為最佳料液比。

圖1 料液比對(duì)花青素提取的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction of anthocyanins

2.1.2 酶添加量對(duì)花青素提取的影響

由圖2可知，當(dāng)酶添加量增加時(shí)，花青素含量呈現(xiàn)先緩慢增加后迅速增加的趨勢(shì)，酶添加量達(dá)到4 mg/g時(shí)花青素含量達(dá)到最高值，之后趨勢(shì)基本保持穩(wěn)定。這是因?yàn)槊附到饧?xì)胞壁有利于花青素的溶出。當(dāng)酶添加量≤4 mg/g時(shí)，細(xì)胞壁開(kāi)始被降解，花青素含量開(kāi)始緩慢增加；隨著酶添加量增加，細(xì)胞壁降解增多，導(dǎo)致花青素含量迅速增加。當(dāng)酶添加量達(dá)到4 mg/g時(shí)，細(xì)胞壁降解完全，故此時(shí)花青素含量達(dá)到最高值。而當(dāng)酶添加量>4 mg/g時(shí)，細(xì)胞壁的降解已經(jīng)比較充分，花青素的溶出量基本保持穩(wěn)定，繼續(xù)添加酶對(duì)提高花青素含量的效果不明顯。因此，選擇4 mg/g作為最佳酶添加量。

圖2 酶添加量對(duì)花青素提取的影響Fig.2 Effect of enzyme additive amount on extraction of anthocyanins

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)花青素提取的影響

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的增加，花青素含量呈先升后降的趨勢(shì)，在30 min時(shí)，花青素含量達(dá)到最高值。在超聲初期，溶劑中花青素含量少，紫色馬鈴薯粉末中花青素含量多，兩個(gè)體系間存在較高的濃度差，傳質(zhì)推動(dòng)力大，所以花青素溶出快。但當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，由于花青素的熱穩(wěn)定性較差，長(zhǎng)時(shí)間高溫提取會(huì)導(dǎo)致花青素發(fā)生變性，溶液中的花青素含量會(huì)降低。因此，選擇30 min作為最佳提取時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)花青素提取的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of anthocyanins

2.1.4 超聲溫度對(duì)花青素提取的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素含量呈先升后降的趨勢(shì)，40 ℃時(shí)花青素含量達(dá)到最高值。這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)升高溫度有利于花青素的提取，升高溫度能提高花青素的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，也有利于提高細(xì)胞膜的通透性，從而提高花青素的提取率。但高溫容易導(dǎo)致花青素被氧化或降解，所以當(dāng)超聲溫度高于40 ℃時(shí)花青素含量會(huì)降低[14]。因此，選擇40 ℃作為最佳提取溫度。

圖4 超聲溫度對(duì)花青素提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction of anthocyanins

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)、酶添加量(B)、超聲時(shí)間(C)、超聲溫度(D)為影響因素，以花青素含量(Y)作為響應(yīng)值，通過(guò)Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定紫色馬鈴薯花青素最優(yōu)的提取工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

續(xù) 表

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中結(jié)果進(jìn)行回歸方程擬合，得到花青素含量的響應(yīng)面回歸方程：

Y=1.23+0.030A+0.021B+0.046C+0.033D-0.022AB-(3.750×10-3)AC-0.034AD+(4.500×10-3)BC-0.046BD-(4.250×10-3)CD-0.073A2-0.076B2-0.085C2-0.046D2。

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression models

由表4可知，當(dāng)模型F=12.95時(shí)，P<0.0001，說(shuō)明該模型是極顯著的，當(dāng)失擬項(xiàng)F=4.02時(shí)，P=0.0959>0.05，說(shuō)明模型的失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)R2=0.9283，校正決定系數(shù)RAdj2=0.8566，表示花青素含量的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度，因而證明該模型能夠很好地對(duì)紫色馬鈴薯花青素的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。該模型中的C、A2、B2和C2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.0001)，A、D、BD和D2對(duì)結(jié)果影響較顯著(P<0.01)，B和AD對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。影響花青素含量的主次順序?yàn)槌晻r(shí)間>酶添加量>料液比>超聲溫度。

利用Design-Expert軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，分別做出兩個(gè)交互項(xiàng)之間的等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。在試驗(yàn)所選擇的水平范圍內(nèi)，因素AD、BD之間交互作用對(duì)花青素含量的影響相似，隨著因素水平的增加，花青素含量都呈現(xiàn)先增加達(dá)到最大值后又降低的趨勢(shì)，響應(yīng)值存在最大值，即因素AD、BD之間有一定交互作用。

圖5 因素AD、BD之間對(duì)花青素含量交互影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagrams of the interaction effects between AD and BD on anthocyanin content

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)已建立的回歸方程進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最佳提取工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)、酶添加量4 mg/g。超聲時(shí)間30 min、超聲溫度40 ℃。在此提取工藝條件下提取的紫色馬鈴薯花青素含量理論值可達(dá)到1.25 mg/g。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，條件設(shè)定為料液比1∶31.2 (g/mL)、酶添加量4.04 mg/g、超聲時(shí)間33 min、超聲溫度43 ℃，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得花青素含量為(1.24±0.004) mg/g，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明試驗(yàn)優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是可靠、穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

紫色馬鈴薯花青素屬于天然植物色素，相較于合成色素安全性更高，并且具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，可用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有十分廣闊的應(yīng)用前景[15]。本研究采用酶法-超聲聯(lián)合提取法，對(duì)紫色馬鈴薯花青素的提取工藝進(jìn)行了研究。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件為料液比1∶30 (g/mL)、酶添加量4 mg/g、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度40 ℃。在此條件下紫色馬鈴薯花青素的提取含量可達(dá)(1.25±0.002) mg/g。該結(jié)果可為深層次開(kāi)發(fā)天然色素的研究提供理論依據(jù)，并有益于紫色馬鈴薯花青素在食品工業(yè)中的推廣與應(yīng)用[16]。