杜歆玥 楊慧齡

[摘要] 肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。盡管用于肺癌診斷和靶向治療的技術(shù)取得了進(jìn)步，但由于缺乏精確有效的早期檢測(cè)方法，目前肺癌的診斷和預(yù)后仍然不理想，生存率較低。肺癌由多種機(jī)制參與調(diào)控，其中microRNAs（miRNAs）參與轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控并伴隨著腫瘤整個(gè)發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，近期研究發(fā)現(xiàn)在血清和血漿的生物體液中檢測(cè)到的循環(huán)miRNA表達(dá)異常與肺癌的早期診斷及預(yù)后密切相關(guān)。本文對(duì)循環(huán)miRNA進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的途徑、穩(wěn)定性及其作為肺癌患者早期診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行了綜述和討論。

[關(guān)鍵詞] 循環(huán)miRNA;非編碼小分子miRNA;肺癌;診斷;預(yù)后

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（b）-0031-04

Research progress of circulating miRNA as a noninvasive marker for diagnosis and prognosis of lung cancer

DU Xinyue1，2? ?YANG Huiling1，2

1.Sino-American Cancer Institute， Dongguan Research Management Center， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China; 2.School of Pharmacy， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan? ?523808， China

[Abstract] Lung cancer is one of the malignant tumor with the highest incidence rate and mortality rate in the world， which seriously affects human health. Despite advances in technology for lung cancer diagnosis and targeted therapy，due to the lack of accurate and effective early detection methods， the current diagnosis and prognosis of lung cancer is still not ideal， with a low survival rate. Lung cancer is regulated by a variety of mechanisms， among which microRNAs （miRNAs） participate in gene expression regulation after transcription and accompany the whole process of tumor development. Recent studies have found that abnormal expression of circulating miRNA detected in serum and plasma biological fluids is closely related to early diagnosis and prognosis of lung cancer. In this paper， the pathway， stability and potential biomarker of early diagnosis and prognosis of lung cancer are reviewed and discussed.

[Key words] Circulating miRNA; microRNA; Lung cancer; Diagnosis; Prognosis

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。2018年大約有200萬(wàn)新發(fā)肺癌病例，其中超過(guò)170萬(wàn)人死于肺癌[1-2]。有研究報(bào)道，60%以上的肺癌患者在局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病（階段Ⅲ或Ⅳ）時(shí)被診斷，不適于手術(shù)切除頁(yè)導(dǎo)致預(yù)后不良，這也是造成肺癌高死亡率的原因之一[3-4]。面對(duì)肺癌的高死亡率，接受低劑量螺旋CT（LDCT）篩查的重度吸煙肺癌患者死亡率降低20%，然而由于LDCT的假陽(yáng)性率高，篩查成本高和潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)突出顯示需要探索更好更精確的肺癌診斷和預(yù)后的方法[5-6]。非編碼小分子RNA（miRNA）是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22～24個(gè)核苷酸的miRNA，這些分子通過(guò)負(fù)調(diào)控靶mRNA或蛋白的表達(dá)而對(duì)細(xì)胞功能具有顯著的影響[7]。經(jīng)研究顯示，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，如調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附、腫瘤血管的生成等[8]。與此同時(shí)，在血液及淚液、唾液、尿液、玻璃體液、腦脊髓液、胸膜液、腹膜液、精液、母乳和羊水等各種體液中檢測(cè)到穩(wěn)定存在的循環(huán)miRNA[9]。因此，循環(huán)miRNA在肺癌中扮演著不可或缺的一部分，其最重要的應(yīng)用之一是可以作為非侵入性生物標(biāo)志物用于肺癌的診斷和預(yù)后[7]。

1 循環(huán)miRNA的來(lái)源

理論上miRNA主要通過(guò)以下幾種途徑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)：①?gòu)钠屏鸭?xì)胞被動(dòng)滲漏。在正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)miRNA直接滲漏到循環(huán)系統(tǒng)并不常見(jiàn)，但在組織損傷或細(xì)胞凋亡及壞死的情況下卻可能發(fā)生;②通過(guò)源自細(xì)胞的微囊泡的主動(dòng)分泌。微囊泡是幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞在正常和病理狀態(tài)下都會(huì)分泌的小囊泡，微囊泡主動(dòng)分泌循環(huán)miRNA作為對(duì)各種刺激的反應(yīng)，包括ATP和溫度依賴性，并且類(lèi)似于某些激素和細(xì)胞因子的釋放[10]。③循環(huán)中的Argonaute2（AGO2）復(fù)合物可作為血漿中miRNA的重要載體。絕大多數(shù)（高達(dá)90%）的循環(huán)miRNA以非膜結(jié)合形式與AGO2相關(guān)聯(lián)，AGO2是miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的效應(yīng)組件，可直接結(jié)合不同的miRNA并介導(dǎo)細(xì)胞中的mRNA阻遏[11]。無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物AGO2復(fù)合物的免疫親和富集可能是提高循環(huán)miRNA靈敏度和生物標(biāo)志物性能的有效策略[12]。

2 循環(huán)miRNA的穩(wěn)定性

大多數(shù)RNA在相對(duì)嚴(yán)苛的條件下容易降解，循環(huán)miRNA卻可以穩(wěn)定存在于體液中。循環(huán)miRNA可在室溫下保持穩(wěn)定24 h和經(jīng)歷8次反復(fù)凍融，而合成的循環(huán)miRNA與血漿一起培養(yǎng)時(shí)則會(huì)迅速降解。這種高穩(wěn)定性是由于它們對(duì)內(nèi)源和外源核糖核酸酶（RNase）活性，極端溫度，極端pH（pH1或pH13），冷凍條件下的長(zhǎng)期儲(chǔ)存和反復(fù)凍融的抗性[13]。近期研究顯示釋放的囊泡在大多數(shù)血細(xì)胞的成熟和激活過(guò)程中必不可少，幾乎所有與紅細(xì)胞和血小板相關(guān)的miRNA都被充入循環(huán)囊泡中;另一方面，大部分以非囊泡形式存在的循環(huán)miRNA與蛋白酶敏感復(fù)合物解離后很容易被RNase降解，而這些蛋白質(zhì)如AGO2、GW182、nucleophosmin1（NPM1）和高密度脂蛋白（HDL）均被確認(rèn)為miRNA的載體，當(dāng)從蛋白復(fù)合物中分離出AGO2時(shí)，miRNA發(fā)生降解[14]。所以這種穩(wěn)定性的原因應(yīng)該也與包裝到微泡或者一種稱(chēng)作外來(lái)體的膜性脂類(lèi)囊泡（例如外泌體和凋亡小體）以及核糖核蛋白復(fù)合物（例如AGO2）密切相關(guān)。

3 循環(huán)miRNA作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物

3.1 單個(gè)循環(huán)miRNA作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物

缺乏有效的早期診斷手段是導(dǎo)致肺癌高死亡率的主要原因之一[15]。miRNA表達(dá)在肺癌中經(jīng)常失調(diào)，形成特定的表達(dá)譜，因此有利于肺癌的早期發(fā)現(xiàn)。最近，一項(xiàng)包括134個(gè)肺癌研究的系統(tǒng)性薈萃分析，對(duì)6919例肺癌患者和7064名對(duì)照者的分析顯示循環(huán)miRNA對(duì)Ⅰ～Ⅱ期癌癥的敏感度為83%，特異性為84%，并且曲線下面積（AUC）為0.90，該研究運(yùn)用了大量樣本進(jìn)行各種亞組分析，例如種族，miRNA分析、標(biāo)本、控制源、組織學(xué)類(lèi)型、TNM階段，樣本量和發(fā)表年份等，更加全面地揭示了循環(huán)miRNA在早期肺癌中的診斷意義[16]。Geng等[17]研究發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-20a、miRNA-145、miRNA-221在肺癌患者組與健康對(duì)照組的表達(dá)有明顯差異，AUC值相對(duì)較高，具有高度特異性和敏感度，其中血漿miR-20a和miR-145在吸煙者中的檢測(cè)價(jià)值要高于非吸煙者，3種循環(huán)miRNA均可作為早期肺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。由此可見(jiàn)，血漿miRNA的發(fā)現(xiàn)將為早期準(zhǔn)確診斷非小細(xì)胞肺癌的前景打開(kāi)一扇大門(mén)，它們作為非侵入性的腫瘤特異性生物標(biāo)志物，可以憑借高靈敏度和特異性將患者與健康對(duì)照者區(qū)分。除血漿外，在各種體液中均可檢測(cè)到循環(huán)miRNA，血清也被廣泛用于檢測(cè)miRNA，血清中的miRNA在肺癌診斷中具有非常良好的診斷價(jià)值[18]。相關(guān)研究通過(guò)檢測(cè)肺癌患者和正常對(duì)照者的血清發(fā)現(xiàn)，miR-661、miR-411、miR-181b-5p和miR-486-5p在肺癌患者血清中的表達(dá)相對(duì)正常人群明顯升高，并可作為肺癌診斷的血清標(biāo)志物，其聯(lián)合影像學(xué)檢查對(duì)肺癌的早期診斷效能明顯提高[19-21]。Shi等[22]發(fā)現(xiàn)血清miR-15b檢測(cè)早期肺癌（Ⅰ+Ⅱ期）的敏感度顯著高于CEA，血清miR-22（AUC = 0.725）和miR-15b（AUC = 0.619）對(duì)肺癌的診斷意義均高于血清CEA（AUC = 0.594），具有成為肺癌篩查腫瘤標(biāo)志物的潛力，可作為未來(lái)肺癌早期診斷的參考指標(biāo)。

3.2 多種循環(huán)miRNA的組合作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物

通過(guò)大量文獻(xiàn)研究顯示，在不同情況下，多個(gè)循環(huán)miRNA的組合或與腫瘤標(biāo)志物組合對(duì)肺癌診斷的檢測(cè)更加有效。Sun等[23]對(duì)28例肺癌患者與28名健康對(duì)照者進(jìn)行檢測(cè)，肺癌患者的血漿miR-339-5p水平顯著下調(diào)，血漿miR-21水平顯著上調(diào)，miR-339-5p和miR-21的組合可以區(qū)分早期肺癌患者和健康對(duì)照者，檢測(cè)效果良好，顯著改善了其AUC（0.963）、靈敏度（92.9%）和特異性（92.9%）。因此，血漿miR-339-5p和miR-21的組合可能對(duì)肺癌早期診斷有顯著的價(jià)值。Arab等[14]采用52例早期肺癌患者和50名健康對(duì)照者進(jìn)行研究，其中發(fā)現(xiàn)3種循環(huán)miRNA的組合方式的敏感度和特異性比其單個(gè)miRNA更加顯著，比如miR-21和miR-141組合，其AUC是0.804，敏感度為80.37%，特異性為98.10%;miR-21、miR-141和miR-328組合，其AUC是0.694，敏感度為69.14%，特異性為83.10%;miR-21、miR-141、mir-328和miR-375組合，其AUC是0.623，敏感度為61.75%，特異性為80.30%。提示循環(huán)miRNA的組合可以分別將不同種類(lèi)或數(shù)量的循環(huán)miRNA組合在一起，對(duì)早期肺癌的診斷具有高度敏感度和特異性。Sromek等[24]從50名健康獻(xiàn)血者和肺癌患者中采集血漿，血漿中miR-16、miR-205和miR-486水平顯著高于健康個(gè)體，血漿miR-16、miR-205和miR-486的組合形式的檢測(cè)將肺癌患者與健康人區(qū)分開(kāi)并具有95%的特異性和80%的靈敏度，顯著高于該研究任何單個(gè)miRNA。Halvorsen等[25]對(duì)754種microRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，篩選出6個(gè)具有明顯差異表達(dá)的循環(huán)miRNA（miR-205、miR-200b、miR-125b、miR-34b、miR-429、miR-203），以6個(gè)miRNA的組合形式對(duì)肺癌Ⅰ/Ⅱ期進(jìn)行檢測(cè)篩查，其AUC為0.88，敏感度為85%，特異性為74%，而6個(gè)miRNA的單個(gè)AUC中最高的僅有0.83， 6種microRNA的組合顯示出比單一microRNA有更高的AUC。循環(huán)miRNA以組合的形式在早期肺癌診斷中發(fā)揮了超過(guò)單個(gè)循環(huán)miRNA的生物標(biāo)志物性能。Tang等[26]通過(guò)qPCR檢測(cè)了62例肺癌患者和60名健康吸煙者中3種miRNA（miR-21、miR-145和miR-155）在血漿中的異常表達(dá)。這3種miRNA的組合對(duì)肺癌的診斷率很高（AUC = 0.874），敏感度和特異性分別高達(dá)69.4%和78.3%。此外，該研究還驗(yàn)證了這3種血漿miRNA組合不僅使肺癌患者與健康吸煙者區(qū)分，也將肺癌患者與肺良性結(jié)節(jié)的患者區(qū)分開(kāi)，還具有較高的早期肺癌預(yù)后的檢測(cè)性能，突出了以組合循環(huán)miRNA作為早期診斷肺癌生物標(biāo)志物的優(yōu)越性。

4 循環(huán)miRNA作為肺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物

目前肺功能指標(biāo)、腫瘤狀態(tài)以及體能狀態(tài)等臨床表現(xiàn)均被作為肺癌預(yù)后判斷和治療選擇的參考因素。但肺癌的分子機(jī)制與臨床表現(xiàn)存在一定的差異性，與肺癌相關(guān)的循環(huán)miRNA在參與肺癌發(fā)展的調(diào)控中具有預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值，更好的肺癌預(yù)后判斷應(yīng)納入相關(guān)的分子資料。Su等[27]評(píng)估了100例肺癌患者和100名健康志愿者中的血漿miRNA-195水平，與健康對(duì)照組比較，血漿miRNA-195在肺癌患者中下調(diào)。血漿中低表達(dá)miRNA-195的肺癌患者的總生存期明顯短于血漿中高表達(dá)miRNA-195的肺癌患者，差異表達(dá)的血漿miRNA-195是肺癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。Xu等[28]通過(guò)196例患有肺癌腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）Ⅰ～Ⅲ期的患者并收集外周血樣品進(jìn)行分析，miR-18a、miR-20a和miR-92a的高血漿表達(dá)水平與較短的無(wú)病生存期（DFS）和總生存期（OS）相關(guān)，因此血漿miR-18a、miR-20a和miR-92a水平以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌患者DFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以作為肺癌患者的新型和有希望的預(yù)后生物標(biāo)志物。Sun等[29]測(cè)量了196例肺癌患者和77名健康對(duì)照者血清miR-770的表達(dá)水平，肺癌患者的血清miR-770水平明顯低于健康對(duì)照組，血清miR-770表達(dá)降低與肺癌患者總體生存率低密切相關(guān)，因此，血清miR-770是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。盡管許多miRNA在組織和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但它們作為生物標(biāo)志物的發(fā)展需要通過(guò)侵入性方法收集組織，而不是檢測(cè)外周血這種更加便捷的方法。穩(wěn)定性和易檢測(cè)性使循環(huán)miRNA成為用作癌癥檢測(cè)生物標(biāo)志物的理想候選物。因此，循環(huán)miRNA可以用于早期預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后，進(jìn)而更有效地改善患者預(yù)后。

5 小結(jié)

肺癌在全世界范圍一直都是處于高死亡率的狀態(tài)，癌癥的早期準(zhǔn)確診斷和預(yù)后在降低高死亡率方面起著重要作用。miRNA調(diào)節(jié)多個(gè)基因和不同的信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，是潛在的肺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物?；谘旱难h(huán)miRNA篩選是一種新穎且至關(guān)重要的診斷和預(yù)后的工具，它在臨床環(huán)境中具有創(chuàng)傷性微小、高穩(wěn)定性、易于對(duì)人群進(jìn)行大規(guī)模篩選等巨大研究?jī)?yōu)勢(shì)。在不同情況下，作為早期肺癌診斷的篩選工具，多個(gè)循環(huán)miRNA的組合可能比單個(gè)miRNA更具有敏感度和特異性的指標(biāo)?？傊h(huán)miRNA作為肺癌腫瘤體液的無(wú)創(chuàng)傷性活體檢測(cè)、早期準(zhǔn)確診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，是降低肺癌高死亡率，提高患者生存率的一大革命性發(fā)現(xiàn)，待真正運(yùn)用于臨床，還需繼續(xù)探索與研究。

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（收稿日期：2020-01-22? 本文編輯：封? ?華）