蘭 楊，姜 紅，張仕瑾，彭賢東*，郭廷東，唐志立

(1.南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)部 個(gè)體化藥物治療南充市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000；2.彭州市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 成都 611930)

垂盆草為景天科植物垂盆草(SedumsarmentosumBunge)的干燥全草，具有清熱解毒、利濕退黃的功效，臨床主要用于治療濕熱黃疸、小便不利、癰腫瘡瘍等，將其制成垂盆草顆粒能有效改善肝功能[1-2]。目前，從垂盆草中分離得到的化合物主要有生物堿、黃酮、三萜類(lèi)、揮發(fā)油等，其中黃酮類(lèi)是其最主要的有效成分，具有護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的作用[3-4]。垂盆草分布于全國(guó)各地，但有文獻(xiàn)表明鮮品垂盆草化學(xué)成分受產(chǎn)地和采收季節(jié)影響較大[5]。因此本文建立高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地垂盆草中3種有效成分(槲皮素、山柰素、異鼠李素)的含量，旨在對(duì)比不同產(chǎn)地垂盆草中的化學(xué)成分，以期為優(yōu)選垂盆草藥材資源提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Agilent 1020型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；電子天平(JY2000，上海方瑞儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試藥與試劑

山柰素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110861-201611，含量以95.5%計(jì))，槲皮素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-201610，含量以99.1%計(jì))，異鼠李素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110860-201611，含量以99.8%計(jì))；編號(hào)S1～S15的垂盆草藥材分別來(lái)自湖北、安徽、四川，樣品信息見(jiàn)表1；乙腈和乙酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

表1 樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%乙酸水溶液-乙腈，采用梯度洗脫，程序?yàn)?～5 min，15%乙腈；5～25 min，15%～18%乙腈；25～40 min，18%～23%乙腈；40～50 min，23%～30%乙腈；50～75 min，30%～35%乙腈；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含槲皮素52 μg、山柰素18 μg、異鼠李素15 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

在上述色譜條件下，精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品色譜中槲皮素、山柰素、異鼠李素能與其他雜質(zhì)峰基線分離(見(jiàn)圖1)。

1-槲皮素;2-山柰素；3-異鼠李素

2.5 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得槲皮素回歸方程：Y=47.813X-11.38(R2=0.999 8)；山柰素回歸方程：Y=1.279X+2.84(R2=0.999 8)；異鼠李素回歸方程：Y=15.907X-1.48(R2= 0.999 6)。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果，槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.51%、1.41%、0.56%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定，共6份，按照“2.3”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量分別為：0.04%、0.31%、0.03%，RSD分別為0.95%、0.54%、1.21%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果對(duì)照品峰面積RSD分別為0.98%、1.05%、0.67%，供試品峰面積RSD分別為0.78%、0.89%、0.96%。結(jié)果表明，混合對(duì)照品溶液與供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

取已知槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的本品粉末約0.25 g，精密稱(chēng)定，共6份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別精密吸取10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率為98.7%、99.3%、101.5%，RSD分別為0.87%、1.15%、0.59%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.10 含量測(cè)定

取上述3個(gè)產(chǎn)地15批垂盆草藥材，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，按照所得對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，得到三者的總含量，結(jié)果見(jiàn)表2和圖2。由結(jié)果可知，3個(gè)產(chǎn)地中，湖北產(chǎn)地總含量最高，而安徽和四川產(chǎn)地總含量差異較小。

表2 不同產(chǎn)地槲皮素、山柰素、異鼠李素總含量測(cè)定結(jié)果 (n=3，%)

注：*表示與湖北黃岡比較，差異具有顯著性(P<0.05)。

注：*表示與湖北黃岡比較，差異具有顯著性(P<0.05)。

3 討論

本文在建立液相條件過(guò)程中，分別考察了0.1%乙酸水溶液-乙腈、0.05%乙酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-乙腈3種流動(dòng)相，最終發(fā)現(xiàn)0.1%乙酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，各色譜峰分離效果最佳，故選擇0.1%乙酸水溶液-乙腈為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。通過(guò)測(cè)定全波長(zhǎng)下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)垂盆草在360 nm處吸收強(qiáng)度最大，各峰形和峰高均較好，故本試驗(yàn)選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

三個(gè)產(chǎn)地15批垂盆草含量測(cè)定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地垂盆草中有效成分含量以湖北黃岡產(chǎn)地平均含量最高，而安徽亳州和四川達(dá)州平均含量差異較小。這也提示不同產(chǎn)地垂盆草的化學(xué)成分含量具有差異性，這可能是受當(dāng)?shù)赝寥?、雨水量、溫度、相?duì)濕度和光照等自然因素的綜合影響。已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，控制土壤含水量在70%～80%時(shí)，可同時(shí)保證垂盆草藥材產(chǎn)量和活性成分含量。本實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法可為垂盆草提供簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法，對(duì)比垂盆草藥材三個(gè)產(chǎn)地含量差異可為優(yōu)質(zhì)垂盆草資源的采購(gòu)及研究提供參考依據(jù)。