張秀霞 ，張澤龍 ，孫敬鋒 ，李軍濤 ，王冬梅 ，鄭佩華 ，魯耀鵬 ，冼健安 ，3

（1.天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖與生態(tài)重點實驗室，天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津 300384；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 ?？?571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南 ?？?571101）

光合細(xì)菌（Photosynthetic bacteria,PSB）是一類具有光合色素，能在無氧條件下進行光合磷酸化的微生物。其分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊、海洋、池塘及活性污泥和土壤中[1]。PSB最初應(yīng)用于各類污水處理，后來逐漸引入應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中[2]。PSB在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的研究和應(yīng)用主要集中在調(diào)控、改善和穩(wěn)定養(yǎng)殖水體的水質(zhì)[3-8]，防治疾病的發(fā)生[9]以及利用PSB作為生物餌料和營養(yǎng)性添加劑等[10-11]。在PSB眾多的功能中，有關(guān)水質(zhì)凈化功能的研究最為深入，應(yīng)用效果已得到廣泛認(rèn)同，PSB作為天然的微生態(tài)制劑，具有安全、高效、經(jīng)濟和環(huán)保等優(yōu)點。目前市場上的PSB凈水劑產(chǎn)品繁多，主要以沼澤紅假單胞菌為主，但由于缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品品質(zhì)難以保障，存在活菌含量低、菌體活力低等問題，而PSB凈水劑的凈水效果與菌體的活力密切相關(guān)。另外，由于保持較好的活力狀態(tài)，PSB凈水劑產(chǎn)品均為液態(tài)產(chǎn)品，運輸成本較高。如果可將PSB菌液進行濃縮，同時又保持菌體高活力，則可大大降低成本，有利于促進PSB產(chǎn)品的推廣使用以及健康水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的發(fā)展。張芳蕾等在PSB菌液中添加0.2%預(yù)先溶解糊化的海藻酸鈉靜置絮凝24 h，可得到濃縮10倍的絮凝菌劑[12]。黃業(yè)翔應(yīng)用3%聚合氯化鋁（PAC）作為光合細(xì)菌絮凝劑，接近70%的光合細(xì)菌被絮凝沉降[13]。閆海等比較了4種不同鋁絮凝劑對光合細(xì)菌的絮凝效果，其中PAC的效果最好[14]。一些學(xué)者將PSB進行離心濃縮，再進行固定化后，水質(zhì)凈化效果能夠顯著提高[15-16]。以往的學(xué)者對光合細(xì)菌絮凝劑已做了一些初步篩選，但在實際生產(chǎn)中仍未能得到應(yīng)用。根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，絮凝劑可大致分為三類：無機絮凝劑、有機絮凝劑和生物絮凝劑，該研究比較三類絮凝劑對光合細(xì)菌的絮凝效果，確定適宜的絮凝劑及其適宜濃度與絮凝時間。通過絮凝沉降試驗，探討不同絮凝劑的沉降效果，并對沉降濃縮菌液的活性和凈水效果進行分析，篩選高效的絮凝劑，為光合細(xì)菌菌液產(chǎn)品的濃縮工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗PSB菌株是本實驗室篩選出的沼澤紅假單胞菌，其他主要試劑材料：聚合氯化鋁（PAC）和聚丙烯酰胺陽離子型（MW：800萬，CPAM）購于天津市大茂化學(xué)試劑廠，聚丙烯酰胺陰離子型（MW：800萬，APAM）購于MREDA，酵母采用進口費曼迪斯S-04艾爾啤酒酵母。

PSB培養(yǎng)基：無水乙酸鈉1.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，氯化銨0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，磷酸氫二鉀 0.3 g/L，氯化鈉 1.0 g/L，pH值7.2±0.2。

酵母培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母膏10.0g/L，pH 值 6.5±0.2。

PSB計數(shù)培養(yǎng)基[17]：碳酸氫鈉1.0 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，酵母膏2.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，F(xiàn)e-EDTA0.005g/L，氯化銨1.0g/L，六水合氯化鎂0.2 g/L，氯化鈉 5.0g/L，瓊脂粉 18 g/L，pH 值 7.6±0.2。

1.2 四種絮凝劑的沉降效果試驗

1.2.1 光合細(xì)菌和酵母菌的活化 PSB培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min，按20%接種量接種PSB菌液，于30℃，光強2 300 lx的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，測OD660值為1.6～1.8，備用。酵母培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min，按2%接種量接種酵母干粉，于27℃，250 r/min的搖床中培養(yǎng)72～96 h，菌液分裝至無菌離心管中，6 000 r/min離心5 min，去掉上清液收集沉淀，收集的沉淀用0.9%無菌生理鹽水洗滌2次。

1.2.2 絮凝劑沉降試驗 絮凝劑按要求稱量好，加入1L PSB菌液中充分?jǐn)嚢枋怪耆芙?，溶解完畢取樣檢測OD660值，并將菌液倒入imhoff漏斗中靜置，觀察沉降效果，記錄沉降到目標(biāo)時間沉降菌液體積，檢測上清液的OD660，計算絮凝率。根據(jù)實際靜置絮凝情況，PAC和CPAM組靜置絮凝1 h，APAM和酵母菌組靜置絮凝10 h。每組設(shè)置3個平行。

絮凝率=（混合均勻菌液OD660-上清液OD660）/混合均勻菌液OD660×100%

1.3 模擬養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)液的配制

1.3.1 飼料浸出液母液 取市場上購買的對蝦飼料50 g加1 L海水，海水鹽度30，4℃冰箱浸泡過夜，用200目尼龍篩過濾3次，121℃，滅菌20 min，備用。

1.3.2 模擬養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)液配制取 養(yǎng)殖廢水，要求氨氮與亞硝酸鹽在目標(biāo)值以上，121℃，滅菌20 min，備用。用上述飼料浸出液母液加養(yǎng)殖廢水稀釋，配制成目標(biāo)培養(yǎng)液，分裝至三角瓶，每瓶加400 mL培養(yǎng)液，121℃，滅菌20 min，備用。

1.4 沉降后的菌體活性測定

PSB計數(shù)培養(yǎng)基121℃，滅菌20 min，倒平板備用。根據(jù)1.2的結(jié)果選擇合適的絮凝劑及濃度進行試驗，方法同1.2，沉降到目標(biāo)時間后用移液器小心吸出上清液，取底部沉降菌液檢測OD660，并將底部沉降菌液稀釋到合適倍數(shù)平板涂布檢測活菌數(shù)，每組設(shè)置3個平行。

1.5 沉降后的菌體凈水能力的測定

分別取不同濃度PAC沉降1 h的菌液20 μL添加至400 mL模擬養(yǎng)殖廢水中，添加20 μL未加絮凝劑的PSB菌液作為陽性對照組，不添加PSB菌液作為陰性對照組。每組設(shè)置3個平行。COD、氨氮和亞硝酸鹽均采用Lovibond水質(zhì)分析儀及相應(yīng)試劑盒進行測定。

COD 去除率=（初始 COD-檢測 COD）/初始COD×100%；

氨氮去除率=（初始氨氮-檢測氨氮）/初始氨氮×100%；

亞硝酸鹽去除率=（初始亞硝酸鹽-檢測亞硝酸鹽）/初始亞硝酸鹽×100%。

2 結(jié)果

2.1 四種絮凝劑的沉降效果

PSB菌液中添加PAC后，菌液迅速形成絮狀物并開始分層，絮狀物快速聚集沉降，隨著PAC濃度的增加，上清液顏色越來越淡，沉降菌液體積越來越大。PSB菌液中加入CPAM后，迅速形成較大塊的絮凝物，菌液變粘稠，絮凝物或沉于底部或粘附于imhoff漏斗壁或懸浮于液體中，晃動imhoff漏斗懸浮的絮狀物會逐漸沉于底部。PSB菌液中加入APAM后菌液變粘稠，有小絮狀物懸浮于菌液中但不沉降，底部有黏液狀透明物。PSB菌液中加入酵母菌后，菌液變渾濁，有顆粒狀絮凝物漂浮在菌液中，隨后緩慢沉降。四種絮凝劑對PSB的沉降效果如圖1。

加入PAC、APAM、酵母菌3種絮凝劑混合均勻后，OD值與對照組相比，均有不同程度的增加，其中添加酵母菌后，菌液變渾濁，OD值增加最大；添加CPAM混合均勻后，菌液迅速絮凝成塊狀物，菌液OD值降低。結(jié)果如表1，靜置30 min后，PAC組的沉降效果已十分明顯，最高絮凝率為96.13%；CPAM組也有明顯的沉降，最高絮凝率為39.06%，APAM和酵母菌組的沉降不明顯。與靜置沉降30 min相比，1 h后PAC和CPAM組的絮凝率有所增加，絮凝率最高分別為96.86%和42.20%。APAM組和酵母菌組的沉降時間延長至10 h，絮凝率為3.52%和34.96%。四種絮凝劑的絮凝率均隨絮凝劑添加濃度上升而增加。綜合總體情況，絮凝效果最好為濃度2 000 mg/L的PAC，靜置時間30 min。

2.2 PAC沉降濃縮菌液的菌體活性

根據(jù)2.1的結(jié)果，絮凝劑PAC對PSB的沉降效果最好，因此挑選PAC沉降濃縮1h的菌液進行活菌濃度測定，結(jié)果如表2，隨著PAC添加量的上升，菌液的OD660下降，活菌濃度也相應(yīng)減少。500 mg/L的PAC組的活菌濃度最高，是對照組的19.9倍。菌液OD660和活菌濃度進行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2，菌液OD660和活菌濃度呈顯著的正相關(guān)線性關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)R2=0.989。

2.3 PAC沉降濃縮菌液的凈水效果

取添加不同濃度PAC沉降濃縮1 h后的菌液進行凈水效果試驗，結(jié)果如圖3～圖6。沒有添加菌液的陰性對照組在5 d的試驗期內(nèi)COD、氨氮和亞硝酸鹽均沒有顯著變化。添加非濃縮菌液的陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液的試驗組，COD均持續(xù)下降，前48 h下降迅速，而后逐漸趨緩。500 mg/L和1 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的COD降解速度較快，陽性對照組降解速度最慢。120 h后，各PAC濃縮菌液組之間的COD去除率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均顯著高于陽性對照組（圖3）。

表1 絮凝劑對光合細(xì)菌的絮凝效果

表2 PAC絮凝沉降1 h后濃縮菌液的OD值與活菌濃度

圖2 PAC沉降1 h后濃縮菌液的OD660和活菌濃度的線性關(guān)系

陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液組的氨氮含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。陽性對照組氨氮含量在前72 h上升，96 h開始下降。PAC沉降濃縮菌液組氨氮含量在前48 h上升，72 h開始下降。120 h后，500 mg/L、1 000 mg/L和 1 500 mg/L的 PAC 濃縮菌液組的氨氮含量略低于初始值，其中500 mg/L的PAC濃縮菌液組的氨氮去除率最高，2 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的氨氮含量恢復(fù)到初始值水平，陽性對照組的氨氮含量仍顯著高于初始值（圖4）。

陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液組的亞硝酸鹽含量均持續(xù)下降，且在48 h時亞硝酸鹽含量均已降至0.1 mg/L以下。前24 h，PAC沉降濃縮菌液組的亞硝酸鹽降解速度顯著高于陽性對照組（圖5）。

3 討論

3.1 不同絮凝劑對PSB的沉降效果

圖3 PAC沉降菌液對COD的降解效果

圖4 PAC沉降菌液對氨氮的降解效果

PAC是新型無機高分子絮凝劑，在水中發(fā)生水解反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，水體中的細(xì)微顆粒或膠體污染物在中間產(chǎn)物的作用下進行吸附電中和、吸附架橋或吸附卷掃等作用，使這些細(xì)微物質(zhì)脫離穩(wěn)定狀態(tài)，生成粗大的絮凝體，從而沉降下來[18]。該試驗中，PAC加入液相后，快速水解成Al(OH)3，在水中與PSB菌體所帶的負(fù)電荷瞬間產(chǎn)生中和作用而迅速絮凝，并進一步架橋生成大絮團而快速沉降。

圖5 PAC沉降菌液對亞硝酸鹽的降解效果

PAM為人工合成有機高分子絮凝劑，按其所帶電荷屬性可分為陽離子型、陰離子型、非離子型、兩性型四種類別，PAM絮凝主要通過電中和、吸附架橋或吸附卷掃等，使顆粒聚成較大的絮體，進而沉降[19]。PSB培養(yǎng)基pH值在7.4～8.0之間，大于氨基酸等電點，所以其表面帶負(fù)電荷，而該試驗中所用CPAM帶正電荷，與PSB能通過電中和吸附等作用形成較大絮凝體進而沉降；APAM帶負(fù)電，與PSB不能產(chǎn)生電中和作用，故只有小絮凝物，無法沉降。

絮凝是酵母的可遺傳特性之一，絮凝特性受絮凝基因控制，不同種酵母絮凝性不同[20]。酵母細(xì)胞壁上的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)和N-乙肽葡萄糖胺等成分均可用作絮凝劑。微生物絮凝機理被廣泛接受的主要有吸附架橋、吸附-電中和、沉析物網(wǎng)捕等[21-22]。該研究結(jié)果顯示，添加酵母對PSB具有一定的絮凝沉降作用，但效果較差，且所需的時間較長。

圖6 PAC沉降菌液的COD、氨氮和亞硝酸鹽去除率

比較4種絮凝劑，PAC對PSB的絮凝沉降效果最佳，沉降迅速，時間短。各類絮凝劑的添加濃度越高，絮凝率越高。PAC添加量為2 000 mg/L時，30 min的絮凝率即可達(dá)到96.13%。

3.2 PAC絮凝沉降對光合細(xì)菌菌體活力的影響

PAC添加量越高，絮凝率越高，但從表2可見，濃縮菌液中的菌體活力呈現(xiàn)了相反的趨勢，即單位體積菌液的活菌數(shù)量反而減少。在絮凝沉降過程中發(fā)現(xiàn)，PAC添加量越高，絮凝物沉淀部分的體積也越大，但結(jié)構(gòu)變得松散，這可能是活菌濃度反而下降的主要原因；另外，PAC添加量是否對PSB產(chǎn)生毒性影響而降低活菌濃度，仍有待進一步研究。根據(jù)活菌濃度，PAC添加量以500 mg/L為宜，經(jīng)濃縮后活菌濃度可達(dá)到原來的19.9倍。

3.3 PAC絮凝沉降對光合細(xì)菌凈水能力的影響

研究結(jié)果顯示，該試驗所用的PSB菌株對水體COD和亞硝酸鹽均有很強的降低能力，而氨氮則呈現(xiàn)了先升高后下降的趨勢。PSB既能利用無機氮源也能利用有機氮源，但菌體不能直接利用有機氮源，有機氮源需轉(zhuǎn)化為NH4+才能為細(xì)菌所用[23]。該研究結(jié)果表明，該菌株優(yōu)先分解利用有機氮源，轉(zhuǎn)化有機氮源為NH4+，導(dǎo)致氨氮含量在試驗前期上升。48 h后，PAC濃縮菌液使COD降解約50%，此時COD的下降趨于緩慢，氨氮含量也開始下降。與未經(jīng)濃縮的菌液對比，PAC濃縮菌液的COD降解速度略優(yōu)，而氨氮含量由上升轉(zhuǎn)為下降則提前了24 h。在120 h后，陽性對照組的氨氮含量仍高于初始值，PAC濃縮菌液組的氨氮含量已恢復(fù)或低于初始水平。

亞硝酸鹽是水體主要毒性污染物之一，它對水產(chǎn)動物的危害主要表現(xiàn)在其會氧化水產(chǎn)動物體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白成為高鐵血紅蛋白，減弱血紅蛋白的攜氧能力，使水產(chǎn)動物缺氧[24]。光合細(xì)菌降解亞硝酸鹽是通過自身的代謝特征，將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，試驗證明此菌株有很強的亞硝酸鹽降解能力，未經(jīng)濃縮和PAC濃縮的菌液均在48 h時將亞硝酸鹽降解完畢。但從24 h數(shù)據(jù)可看出，經(jīng)過PAC濃縮的菌液的亞硝酸鹽降解速度優(yōu)于未經(jīng)濃縮菌液。

對不同PAC添加量濃縮的菌液進行比較發(fā)現(xiàn)，500 mg/L和1 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的COD降解速度略優(yōu)于其他PAC添加量濃縮菌液組，500 mg/L的PAC濃縮菌液組的120 h氨氮去除率最高。這些結(jié)果與濃縮后菌體活力的檢測結(jié)果相一致，500 mg/L的PAC濃縮菌液的活菌濃度最高，因而凈化能力也較強。雖然提高PAC的添加量，能夠提高絮凝率，但活菌濃度以及凈水能力反而下降，因此建議選用PAC作為PSB沉降濃縮的絮凝劑，添加濃度以500 mg/L為宜，沉降濃縮時間為1 h。