劉士蒙，李嘉倩，呂昌銀，劉然，李詩(shī)雅，楊桂英

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 衡陽(yáng)市健康危害因子檢驗(yàn)檢疫新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

近年來(lái)，納米材料的快速發(fā)展為開(kāi)發(fā)人工模擬酶提供了新思路[1]。納米酶廣泛應(yīng)用于免疫測(cè)定和生物傳感器等領(lǐng)域。其中，金納米團(tuán)簇，由于其毒性低，生物相容性好，催化性能優(yōu)異，已被廣泛用于生物檢測(cè)[2]。菠蘿蛋白酶(Bromelain)屬于巰基蛋白酶，是一種植物源性蛋白質(zhì)[3-4]，是制備金屬納米團(tuán)簇的理想模板，且很少應(yīng)用于納米材料合成。

Hg(II)離子通常被認(rèn)為是毒性很強(qiáng)的重金屬離子，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生活環(huán)境。因此，Hg2+的靈敏檢測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)水環(huán)境非常重要，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了高效液相色譜法[5]、原子吸收光譜法、ICP-MS法、冷蒸氣原子熒光光譜法[6]等來(lái)檢測(cè)Hg2+。然而，這些方法儀器昂貴，樣品制備過(guò)程耗時(shí)、復(fù)雜，限制了在現(xiàn)場(chǎng)分析中的應(yīng)用。

本文建立了檢測(cè)環(huán)境水樣中Hg2+的新型比色傳感新方法，具有低成本、高選擇性、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并成功應(yīng)用于環(huán)境水樣中Hg2+的檢測(cè)。目前，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用菠蘿蛋白酶作為模板合成金納米簇，利用其模擬酶活性檢測(cè)金屬離子的報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

菠蘿蛋白酶(Bromelain)、氯金酸(HAuCl4)、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(100.0 μg/mL)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、雙氧水均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為滅菌超純水(電阻為18.25 MΩ·cm)。

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；THERMO-SHAKER恒溫混合器；Titan G2 60-300透射電子顯微鏡；K-Alpha 1063 X射線光電子能譜儀；HGG-1102遠(yuǎn)紅外線鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 Bromelain-AuNCs的合成

取90 μL HAuCl4溶液(10 mmol/L)和400 μL菠蘿蛋白酶溶液25 mg/mL(pH 8.0)，充分混合，室溫孵育5 min；然后加入45 μL NaOH溶液(1 mol/L)，在恒溫孵育儀中37 ℃、800 r/min繼續(xù)孵育12 h，合成Bromelain-AuNCs。

1.3 Hg2+標(biāo)準(zhǔn)系列的紫外分光光度檢測(cè)方法

在2 mL EP反應(yīng)管中，依次加入pH=3.75，200 mmol/L 的NaAc-HAc緩沖液100 μL，Bro-AuNCs 25 μL，5 mmol/L TMB 30 μL，100 mmol/L H2O2110 μL以及不同濃度的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后，于 37 ℃恒溫混勻儀中反應(yīng) 45 min。再加入 200 mmol/L H2SO4終止液 80 μL，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)比色測(cè)定，記錄體系在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.4 環(huán)境水樣中Hg2+的測(cè)定

分別采集湘江水、池塘水、自來(lái)水環(huán)境水樣，水樣經(jīng)定量濾紙過(guò)濾 3次后，置于電爐上加熱煮沸持續(xù)15 min。靜置冷卻，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，用1.3節(jié)的分析方法測(cè)定環(huán)境水樣中的Hg2+。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米簇的表征

圖1 體系紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜(A)和Bro-AuNCs 在5個(gè)月內(nèi)的熒光穩(wěn)定性(B)Fig.1 The UV-visible absorption and fluorescencespectra of the system of Bro-AuNCs(A) and thefluorescence stability of Bro-AuNCs within 5 months(B)

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜表征 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菠蘿蛋白酶和菠蘿蛋白酶金納米簇的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectrum ofbromelain and bromelain-AuNCs

由圖2可知，1 600～1 700 cm-1為蛋白酶的酰胺Ⅰ譜帶，其中1 629 cm-1為蛋白酶α螺旋部分的特征峰，由Bromelain穩(wěn)定的金納米簇在1 631 cm-1的特征峰有較為明顯的增強(qiáng)，1 631.78 cm-1的特征峰位移到1 629.85 cm-1，1 000～1 200 cm-1的特征吸收峰消失，表明金納米簇的形成主要和蛋白酶的α螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[9]。已有研究把酰氨Ⅰ帶主要?dú)w屬于C—O鍵伸縮振動(dòng)及肽鍵的C—N伸縮振動(dòng)。2 304 cm-1左右的 —SH特征吸收峰在金納米簇中明顯增強(qiáng)，表明了蛋白酶的 —SH與Au形成了Au—SH鍵。

2.1.3 TEM測(cè)試和XPS表征 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用透射電子顯微鏡(TEM)測(cè)試表征了Bro-AuNCs的形貌和結(jié)構(gòu)，由圖3A表明，AuNCs呈球形，分布均勻，通過(guò)軟件分析，AuNCs的粒徑為0.9～2.8 nm，平均粒徑(1.7±0.3)nm。X射線能量色散光譜(EDX)結(jié)果(圖4A)表明，該物質(zhì)主要元素為Au元素，與文獻(xiàn)報(bào)道AuNCs的特征一致[10]。X射線光電子能譜(XPS)研究(圖4B)表明，金的4f頻譜被分成兩個(gè)峰，結(jié)合能分別為84.02，84.77 eV，分別對(duì)應(yīng)零價(jià)金和一價(jià)金，表明反應(yīng)中生成了Au0和Au+，由金納米簇的擬合數(shù)據(jù)可以看出，主要形成了Au0。

圖3 TEM測(cè)試圖和粒徑分布圖Fig.3 The TEM images and the picture size distribution figureA.Bro-AuNCs TEM；B.Bro-AuNCs粒徑分布；C.Bro-AuNCs+Hg2+TEM；D.Bro-AuNCs+Hg2+粒徑分布

圖4 金納米簇的X射線能量色散光譜圖(A)和X 射線光電子能譜圖(B)Fig.4 The EDX spectrum(A) and XPSspectrum(B) of Bro-AuNCs

2.2 實(shí)驗(yàn)原理

構(gòu)建了一種汞抑制 Bro-AuNCs模擬過(guò)氧化物酶活性新型比色傳感新方法，實(shí)驗(yàn)原理見(jiàn)圖5。

圖5 基于Bro-AuNCs-TMB-H2O2體系檢測(cè)Hg2+示意圖Fig.5 Schematic diagram of detection of Hg2+ ions based on Bro-AuNCs-TMB-H2O2 system

由圖5可知，Bro-AuNCs具有較高的過(guò)氧化物酶活性，當(dāng)體系中存在Hg2+時(shí)，由于AuNCs表面Au+與Hg2+之間的高親和力金屬親和作用，Hg2+會(huì)增大AuNCs的粒徑并使其發(fā)生團(tuán)聚，大大降低AuNCs的催化能力，使Bro-AuNCs體系顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色。通過(guò)測(cè)定加入Hg2+后體系吸光度值的改變量(ΔA)，可以計(jì)算出汞離子的含量，在一定汞離子濃度范圍內(nèi)，ΔA值與汞離子濃度之間的定量關(guān)系為ΔA=Kc。據(jù)此，本文建立了基于Bro-AuNCs比色傳感法定量測(cè)定Hg2+的新方法。

2.3 Hg2+抑制Bro-AuNCs介導(dǎo)的催化顯色反應(yīng)機(jī)制探討

首先通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜對(duì)加入 Hg2+后Bro-AuNCs的酶活性變化進(jìn)行驗(yàn)證(圖6A曲線a～f)。TMB溶液(曲線 a)和 H2O2-TMB溶液(曲線b)體系在450 nm 處都沒(méi)有明顯的吸收峰。在 Bro-AuNCs體系中，TMB-H2O2顯色反應(yīng)增強(qiáng)，A450顯著增強(qiáng)(曲線f)，這表明本研究合成的Bro-AuNCs具有較高的過(guò)氧化物酶活性；當(dāng)加入Hg2+后，Bro-AuNCs-Hg2+-TMB-H2O2體系的A450值顯著降低(曲線e)。這一現(xiàn)象可能是由于Hg2+與Bro-AuNCs發(fā)生了相互作用后，Bro-AuNCs的過(guò)氧化物酶活性減弱，從而抑制TMB氧化顯色。

進(jìn)一步探討了各體系在 60 min內(nèi)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線(圖6B)，TMB-H2O2體系顯色隨時(shí)間增加而增強(qiáng)(曲線g)。當(dāng)加入Bro-AuNCs后，A652吸光度值顯著增強(qiáng)，表示Bro-AuNCs顯示出較高的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性催化TMB 氧化顯色(曲線i)。當(dāng)加入 Bro-AuNCs和Hg2+后，0～3 000 s 內(nèi)顯色反應(yīng)緩慢被抑制；3 000 s后，顯著小于 TMB-H2O2體系(曲線h)。TEM測(cè)試結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)體系中加入Hg2+后，Bro-AuNCs的平均粒徑由原本的2 nm增大到7.5 nm左右。這進(jìn)一步確證了由于AuNCs表面Hg2+和Au+之間的高親和力金屬親和作用，Hg2+誘導(dǎo)AuNCs的粒徑增大并使其團(tuán)聚，抑制其過(guò)氧化物酶活性。

圖6 不同體系中紫外吸收?qǐng)D譜(A)和體系中60 min內(nèi)吸光度-時(shí)間曲線(B)Fig.6 The UV absorption spectrum mechanism ofdifferent systems(A) and absorbance-time curvein 60 min of the system(B)

2.4 共存物質(zhì)影響

圖7 不同金屬離子對(duì)測(cè)定體系吸光度值的影響Fig.7 The effect of different interfering ions on the absorbance value of the measurement system

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與精密度

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，配制Hg2+標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行定量分析實(shí)驗(yàn)，建立了測(cè)定Hg2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖8。

圖8 Bro-AuNCs-TMB-H2O2-Hg2+傳感系統(tǒng)的比色圖、熒光光譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.8 The visual observation(A)，fluorescencespectrum(B) and calibration curves(C) of theBro-AuNCs-TMB-H2O2-Hg2+ sensing system

由圖8可知，當(dāng)Hg2+濃度在 6.25×10-9～3.5×10-6mol/L時(shí)，A450的吸光度值隨著Hg2+濃度的增加而逐漸降低，溶液顏色逐漸減弱，由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\藍(lán)色。此時(shí)，體系中吸光度差值ΔA與Hg2+濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為ΔA=0.000 7+0.191cHg(II)，相關(guān)系數(shù)r=0.996，經(jīng)LOD=3Sb/k 計(jì)算，檢出限為 4.3×10-3μmol/L。對(duì)汞離子濃度為0.2，1.75，3 μmol/L的三種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行11次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.65%，0.85%，3.0%，方法精密度良好。

2.6 環(huán)境水樣分析

按照標(biāo)準(zhǔn)采樣方法分別采集了5個(gè)不同來(lái)源的環(huán)境水樣，對(duì)樣品實(shí)施煮沸、過(guò)濾等預(yù)處理操作，按照測(cè)定Hg2+的方法分別測(cè)定 5 個(gè)環(huán)境水樣中汞的含量。隨后，采用真實(shí)樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)5個(gè)環(huán)境水樣中分別添加濃度為0.375，1.75，3 μmol/L 的汞標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定11次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 環(huán)境水樣中 Hg2+ 的加標(biāo)回收率Table 1 Actual measurement and analysis of Hg2+ inenvironmental water samples

注：1.湘江水(上游)；2.湘江水(中游)；3.湘江水(下游)；4.池塘水；5.實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水。

由表1可知，Hg2+的測(cè)定加標(biāo)回收率為98.36%～103.95%，以上結(jié)果表明本方法可用于實(shí)際環(huán)境水樣中Hg2+的檢測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

制備了一種具有優(yōu)良的熒光特性、較高的過(guò)氧化物酶活性的菠蘿蛋白酶金納米簇材料(Bro-AuNCs)，能夠代替天然酶，有效提高了穩(wěn)定性，可應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。Hg2+能有效抑制Bro-AuNCs過(guò)氧化物酶活性，據(jù)此建立了高靈敏、高選擇性測(cè)定環(huán)境水樣中 Hg2+的比色傳感平臺(tái)。本文進(jìn)一步探討了Hg2+抑制Bro-AuNCs介導(dǎo)的催化顯色反應(yīng)機(jī)制，為新型蛋白質(zhì)-金納米簇的合成提供了新思路和新依據(jù)；拓寬了納米材料模擬酶的應(yīng)用。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏、檢測(cè)效率高，有望在環(huán)境檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)、生物傳感等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。