謝益仙 肖志紅 吳 紅,,3 黎繼烈 張愛(ài)華, 李培旺 田 宏

(中南林業(yè)科技大學(xué)1，長(zhǎng)沙 410004)湖南省林業(yè)科學(xué)院油脂分子構(gòu)效湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)沙 410004)(湖南省林業(yè)科學(xué)院南方木本油料利用科學(xué)國(guó)家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，長(zhǎng)沙 410004)(湖南糧食集團(tuán)有限公司4，長(zhǎng)沙 410005)(南開(kāi)大學(xué)5，天津 300071)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)被譽(yù)為世界四大木本油料之一[1]，屬茶科，常綠小喬木。油茶籽是我國(guó)重要的食用油原料，壓榨茶油后得到油茶餅，茶油餅中仍富含茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質(zhì)、角鯊烯等多種天然活性成分[2-4]。茶皂素是一種糖式化合物，是一種天然非離子型表面活性劑[5]，具有鎮(zhèn)痛、抗?jié)B透等藥理作用[6，7]，水提法和乙醇提取法的茶皂素碳水化合物含量高，進(jìn)一步純化利用較為困難[8]。磷脂是天然表面活性劑，具有生理調(diào)節(jié)機(jī)能，在人體的新陳代謝、免疫力的提高、疾病的預(yù)防等方面都有一定的作用[ 9，10 ]，廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品、紡織品、石油化工等行業(yè)[11]。油茶餅的開(kāi)發(fā)利用有利于資源的再利用，可以產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。

油茶餅多組分提取方法有水提法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、亞臨界萃取法等。水提法設(shè)備條件要求不高、成本低、但目標(biāo)產(chǎn)物提取率較低且需分步提取多組分，朱俊朋等[12]采用水提-醇萃法提取油茶餅中茶皂素時(shí)，在最佳提取條件下茶皂素提取率達(dá)到8.33%，提取率較低；有機(jī)溶劑萃取法成本低、效率高但產(chǎn)品的后續(xù)處理較為復(fù)雜且產(chǎn)品質(zhì)量不高，宗毅等[13]采用超聲波-甲醇法提取茶皂素，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下的茶皂素純度達(dá)到59.30%；超臨界CO2萃取和亞臨界萃取操作簡(jiǎn)單、目標(biāo)產(chǎn)物提取率高但成本較高、設(shè)備投資較大且較難實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。總之，目前針對(duì)油茶餅中殘油、茶皂素、磷脂等多組分的提取技術(shù)存在耗時(shí)耗能、安全性低、產(chǎn)品質(zhì)量不高的缺陷。根據(jù)本課題組前期研究得出醇基溶劑對(duì)油茶餅同步萃取效果優(yōu)于常規(guī)有機(jī)溶劑，如以正丁醇水溶液為溶劑對(duì)茶皂素和茶油的同步提取，茶油提取率達(dá)到92.88%，茶皂素提取率達(dá)到43.20%[14]，實(shí)現(xiàn)了茶油、皂素和磷脂等多組分的同步萃取，而且后期通過(guò)簡(jiǎn)單的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)就可以逐步實(shí)現(xiàn)油脂、皂素和磷脂的分離。與傳統(tǒng)方法對(duì)比，正丁醇水提取顯示出一定的優(yōu)勢(shì)。因此，本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，著力于正丁醇對(duì)油茶餅中多組分同步萃取的研究工作，重點(diǎn)探究正丁醇同步萃取油茶過(guò)程中更多組分溶出規(guī)律及其相互作用對(duì)茶皂素純度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶籽餅：湖南省林業(yè)科學(xué)院；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品；正丁醇、無(wú)水乙醇、石油醚、香草醛、濃硫酸、硫酸肼等試劑均為分析純。

UV-2800雙光束/紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；SZF-06A粗脂肪測(cè)定儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 油茶餅原料的組分分析方法

2.1.1 油茶餅原料水分及揮發(fā)物的測(cè)定

油茶餅原料中水分及揮發(fā)物的測(cè)定方法同GB/T 10358—2008《油料餅粕水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定》。

2.1.2 茶油的測(cè)定

油茶餅及濾渣中含油率的測(cè)定方法同GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測(cè)定》。

(1)

式中：M1為參與同步萃取的茶籽餅原料質(zhì)量/g；P1為茶籽餅原料中的含油率/%；m1為茶籽餅濾渣的質(zhì)量/g；P2為測(cè)得的茶籽餅濾渣的殘油率/%。

2.1.3 茶皂素含量的測(cè)定

茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量的測(cè)定按文獻(xiàn)[15]方法操作。可得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=1.082 6x+0.002 7，R2=0.999 5。

(2)

(3)

式中：c為茶皂素質(zhì)量濃度/mg/mL；V為茶皂素溶液的體積/mL；n為茶皂素溶液稀釋倍數(shù)；m為原料中茶皂素質(zhì)量/mg；M為茶皂素提取物質(zhì)量/mg。

2.1.4 磷脂含量的測(cè)定

磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量的測(cè)定方法同GB/T 5537—2008《糧油檢驗(yàn)磷脂含量的測(cè)定》。

可得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=10.88x-0.033 2，R2=0.999。

(4)

式中：c為磷脂質(zhì)量濃度/mg/mL；V為溶液的體積/mL；m為原料中磷脂質(zhì)量/mg。

2.1.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

油茶餅原料及濾渣中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法參考GB/T 31578—2015《糧油檢驗(yàn)糧食及制品中粗蛋白測(cè)定杜馬斯燃燒法》。

2.1.6 碳水化合物含量的測(cè)定

油茶餅原料及溶出物質(zhì)中碳水化合物的測(cè)定按文獻(xiàn)[16]方法操作。

2.1.7 油茶餅多組分同步萃取工藝

稱取500 g粉碎后的油茶餅粕(干基)，與一定體積的正丁醇在不同的pH(3.5～5.5)，溫度(50～90 ℃)，液料比(4∶1～12∶1) mL/g和正丁醇含水量(0%～20%)條件下回流萃取。提取完全后快速以確保體系在同等溫度下離心分離。之后用少量同溫度正丁醇與固體相混合后離心分離2次，合并正丁醇相。小心的收集固體相，用于油脂、皂素、磷脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物的提取率測(cè)定。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，隨著含水量的減少，首先蒸發(fā)出來(lái)的是磷脂，其次是皂素，最后蒸發(fā)出來(lái)的是油脂，從而實(shí)現(xiàn)三組主要物質(zhì)的分離。

2.1.8 響應(yīng)面法優(yōu)化油茶餅多組分同步萃取工藝

采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)固定正丁醇含水量20%、萃取時(shí)間120 min，選取對(duì)油茶餅中茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大的萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立茶皂素溶出率及純度的回歸方程，優(yōu)化茶皂素純度及萃取工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 茶籽餅中主要成分

表1所示為本實(shí)驗(yàn)所用油茶餅中主要成分組成含量。由表1可知，油茶餅具有低蛋白質(zhì)、磷脂含量，高茶皂素含量的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)[17]相比，茶皂素、磷脂含量略高，這是因?yàn)樵袭a(chǎn)地、品種等都不相同。文獻(xiàn)中報(bào)道，雙親性的物質(zhì)如茶皂素、磷脂和蛋白質(zhì)等，對(duì)油脂的溶出有不同程度的促進(jìn)作用，而每種物質(zhì)的促進(jìn)作用又各不相同。本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究各組分溶出的規(guī)律及其相互作用關(guān)系，尤其研究各組分相互作用對(duì)茶皂素純度的影響規(guī)律。

表1 油茶餅中主要成分組成

3.2 不同條件對(duì)油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.1 pH對(duì)油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的pH對(duì)皂素的溶出及純度具有非常顯著的影響作用[18]。茶皂素含有雙親基團(tuán)具有表面活性，其表面活性容易受到體系pH的影響，在文獻(xiàn)報(bào)道中[19]發(fā)現(xiàn)茶皂素在弱酸性環(huán)境中表面活性較高。因此，考察體系pH的影響具有重要意義。

固定萃取溫度80 ℃、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時(shí)間120 min，在pH 3.5～5.5范圍內(nèi)，隨著pH的升高，茶油、茶皂素、磷脂的溶出率及茶皂素純度呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，蛋白質(zhì)的溶出率呈現(xiàn)先減少后增加，碳水化合物溶出率有輕度增加。當(dāng)pH增加到4.5時(shí)，茶油溶出率63.56%升高到74.01%，茶皂素溶出率從87.05%升高到90.60%，磷脂溶出率從29.96%增加到38.02%，茶皂素純度從71.35%增加到77.50%，蛋白質(zhì)溶出率從30.54%降低到27.93%。在提取體系pH變化過(guò)程中茶油、茶皂素、磷脂溶出率及茶皂素純度變化趨勢(shì)相同，與蛋白質(zhì)溶出率變化趨勢(shì)相反，萃取pH對(duì)茶皂素純度影響較大，與胡福田等[20]采用微波預(yù)處理超聲波協(xié)助水浸提茶皂素試驗(yàn)相比茶皂素純度提高22.82%，蛋白質(zhì)溶出率較低，其等電點(diǎn)在4.5左右[21]，體系中茶皂素與茶油分子溶出能力較強(qiáng)，茶皂素能降低水的表面能且對(duì)茶油具有一定的增溶作用[22]。綜合考慮選取pH 4.5為最佳萃取溫度。

3.2.2 溫度對(duì)油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取體系的溫度對(duì)茶皂素的提取率及純度都有較大的影響[23]，溫度過(guò)低，不利于各組分溶出，溫度過(guò)高會(huì)使更多的雜質(zhì)溶出降低茶皂素的純度。

固定萃取pH 4.5、萃取液料比8∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時(shí)間120 min，在溫度50～80 ℃時(shí)，茶油、茶皂素溶出率及茶皂素純度均呈上升趨勢(shì)，低溫影響茶油及皂素在正丁醇水溶液中的溶解度[24]。在80～90 ℃茶油和茶皂素溶出率及茶皂素純度都有少許降低；隨著溫度增加磷脂溶出率從30.48%增加到38.91%，而蛋白質(zhì)和碳水化合物溶出率呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，蛋白質(zhì)溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過(guò)程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢(shì)相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對(duì)茶油溶出的促進(jìn)作用較為明顯，主要是因?yàn)闇囟壬呤褂筒栾灲M織變得疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被出率呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，蛋白質(zhì)溶出率從32.42%減少到25.47%，碳水化合物溶出率從14.70%減少到10.30%。在提取溫度變化過(guò)程中，茶油、茶皂素溶出及茶皂素純度變化趨勢(shì)相同與磷脂溶出變化相似，溫度升高對(duì)茶油溶出的促進(jìn)作用較為明顯，主要是因?yàn)闇囟壬呤褂筒栾灲M織變得疏松，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞；蛋白質(zhì)與碳水化合物溶出趨勢(shì)相同，蛋白質(zhì)和碳水化合物的溶出逐漸減少，溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)和碳水化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞，其活性成分受到影響，蛋白質(zhì)和碳水化合物溶出減少，有利于茶皂素純度的增加。綜合考慮選取80 ℃為最佳萃取溫度。

圖1 pH對(duì)各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖2 萃取溫度對(duì)各組分溶出率及茶皂素純度的影響

圖3 萃取液料比對(duì)各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.3 液料比對(duì)油茶餅多組分溶出率及茶皂素純度的影響

提取液料比對(duì)各成分溶出及茶皂素純度影響不相同，最佳液料比可避免造成資源浪費(fèi)。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、正丁醇含水量20%、萃取時(shí)間120 min，在液料比4∶1 ～12∶1 mL/g范圍內(nèi)，茶油、茶皂素、磷脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物溶出率一直在增加，茶油溶出率從63.48%增加到76.15%，茶皂素溶出率從55.69%增加到92.20%，磷脂溶出率從30.22%增加到39.07%，蛋白質(zhì)溶出率13.99%增加到29.07%，碳水化合物溶出率從4.35%增加到12.04%，隨液料比增加油茶餅中有效成分溶出率趨勢(shì)相同，茶皂素純度呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)，液料比增加有利于溶劑與物料的充分接觸，但液料比較大時(shí)，雜質(zhì)溶出也會(huì)越多。在液料比10∶1 mL/g時(shí)，茶皂素純度達(dá)到最大值78.26%。在該體系中茶皂素分子溶出競(jìng)爭(zhēng)力較大，溶出率增加較為明顯。綜合考慮選取10∶1 mL/g為最佳萃取料比。

3.2.4 正丁醇含水量對(duì)油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

正丁醇、茶皂素、茶油和水互溶后可形成一個(gè)極性可調(diào)的溶劑體2系，該體系具有“雙親增溶”特性，適用于油茶多組分的同步提取。因此考察含水量對(duì)溶出率及茶皂素純度的影響。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、萃取時(shí)間120 min，在正丁醇含水量0～20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))范圍內(nèi)，茶皂素溶出率從19.29%增加到91.54%；茶皂素純度從48.38%提高到78.12%；隨著正丁醇含水量的增加，茶油和磷脂溶出率先輕度降低再增加；蛋白質(zhì)溶出率增加；碳水化合物溶出率隨含水量增加而增加。隨著茶皂素的溶出，能夠有效的改變正丁醇-水體系的極性大小，形成一個(gè)“雙親增溶”體系對(duì)茶油具有一定的增溶作用，從而實(shí)現(xiàn)茶油、茶皂素的同步高效溶出[25]。正丁醇含水量20%時(shí)，茶皂素溶出率為91.54%，純度為78.12%，與易笑生等[26]進(jìn)行的正丁醇(含水量5%)萃取茶皂素和茶油相比，茶皂素溶出率提高48%，茶皂素在水中的溶解性稍大于在正丁醇中的溶解性，由于水在正丁醇中的最大溶解度為20.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，綜合考慮選取正丁醇含水量20%為最佳萃取含水量。

圖4 正丁醇含水量對(duì)各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.2.5 萃取時(shí)間對(duì)油茶餅多組分溶出及茶皂素純度的影響

傳統(tǒng)提取方法中大多數(shù)存在提取時(shí)間長(zhǎng)的缺陷，就會(huì)造成效率低，設(shè)備利用率低等問(wèn)題，縮短時(shí)間能有效的節(jié)約成本，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

固定萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%，在萃取時(shí)間30～120 min范圍內(nèi)，隨時(shí)間的增加茶皂素、茶油、磷脂、蛋白質(zhì)和碳水化合物的溶出率呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。在萃取初期，萃取時(shí)間越長(zhǎng)，各有效成分的溶出率也就越高。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各有效成分溶出率有略微下降，這可能是因?yàn)橛行С煞衷谌軇┲腥芙舛冗_(dá)到飽和，萃取時(shí)間較長(zhǎng)，茶皂素可能發(fā)生水解；在該體系中萃取時(shí)間120 min時(shí)，茶皂素溶出率達(dá)到90.1%，馬力等[27]在以水為溶劑萃取油茶餅中茶皂素時(shí)達(dá)到相似溶出率需要萃取時(shí)間8 h；茶皂素純度隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，萃取時(shí)間越長(zhǎng)雜質(zhì)溶出越多對(duì)茶皂素純度影響越大。綜合考慮選取萃取時(shí)間120 min為最佳萃取時(shí)間。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)各組分溶出率及茶皂素純度的影響

3.3 同步萃取油茶餅多組分最佳工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，萃取pH、萃取溫度、萃取液料比對(duì)茶皂素溶出率及茶皂素純度影響較大，因此響應(yīng)面試驗(yàn)以茶皂素溶出率及茶皂素純度為響應(yīng)值采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以萃取pH、萃取溫度、萃取液料比為自變量對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)因素與水平編碼表如表2及表3所示。

3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到方差結(jié)果，如表4所示。

Y1(茶皂素溶出率)=91.89-1.04A+0.80B+1.79C+0.29AB+0.19BC-2.61A2-0.31B2-1.88C2

Y2(茶皂素純度)=78.72+0.51A+0.33B+0.31C+0.28AC-2.591A2-0.73B2-0.99C2

由表4、表5可知，A、B、C、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值茶皂素的溶出率及茶皂素的純度影響極顯著(P<0.000 1)。失擬差P>0.05，表明模型的失擬度不顯著，回歸系數(shù)R2分別為0.999 2、0.996 4，表明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有良好的擬合性，校正后的復(fù)測(cè)相關(guān)系數(shù)Radj2分別為0.998 2、0.991 7，測(cè)試值與校正值均較大且較為接近，表明該模型擬程度良好。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)因素及其水平表

表3 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 茶皂素溶出率的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

表5 茶皂素純度的回歸方差分析

注：**表示，差異極顯著(P<0.01)；*表示，差異顯著(P<0.05)。

3.3.3 交互作用分析

根據(jù)模型方差分析可以得出萃取pH、萃取液料比和萃取溫度對(duì)茶皂素溶出率影響極顯著，兩因素的交互作用對(duì)茶皂素溶出率的影響較大的是萃取pH和萃取溫度、萃取溫度和液料比。隨著萃取pH的增加，茶皂素溶出率先增加達(dá)到最高值后下降，茶皂素溶出率的下降可能是當(dāng)pH較大時(shí)引起茶皂素的水解[28]；萃取pH與萃取液料比之間交互作用不顯著，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中考察這兩個(gè)變量的范圍較小，沒(méi)有更好的顯示出變量范圍更大后的交互作用變化規(guī)律；萃取溫度對(duì)茶皂素溶出率影響較小。

對(duì)茶油餅中茶皂素純度響應(yīng)值的影響及其交互作用中萃取pH對(duì)茶皂素純度的影響程度最大，萃取溫度次之，萃取液料比影響最小，兩因素的交互作用對(duì)茶皂素純度的影響較明顯的是萃取pH和萃取液料比。隨萃取pH的增加，茶皂素純度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，茶皂素純度降低的原因可能是萃取pH增加會(huì)導(dǎo)致更多雜質(zhì)溶出。

根據(jù)二次回歸方程的數(shù)學(xué)模型分析，得到的最佳萃取工藝條件：萃取pH為4.52、萃取溫度83.80 ℃、萃取液料比10.60 mL/g、在此條件下茶皂素溶出率及茶皂素純度理論值分別為92.50%、78.76%。在驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性的基礎(chǔ)上，為了便于實(shí)際的操作，將最佳工藝條件修正為萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g。

3.3.4 回歸模型的驗(yàn)證

按照優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證BBD設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，試驗(yàn)所得茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%，與理論預(yù)測(cè)值相比無(wú)明顯差異，基本符合理論，表明所建的模型有效。

3.3.5 本方法與醇提和水提對(duì)比

本方法與醇提法、水提法萃取效果對(duì)比見(jiàn)表6，本方法具有提取率高、產(chǎn)品純度較高的優(yōu)勢(shì)。

表6 不同復(fù)合溶劑萃取效果比較

4 結(jié)論

正丁醇/水復(fù)合溶劑處理油茶餅粕，研究各組分溶出的規(guī)律及其相互作用關(guān)系，重點(diǎn)研究各組分的相互作用對(duì)茶皂素純度的影響規(guī)律。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析確定油茶餅多組分同步萃取的工藝條件為萃取pH 4.5、萃取溫度80 ℃、萃取液料比10∶1 mL/g、正丁醇含水量20%、萃取時(shí)間120 min。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察萃取pH、萃取溫度、萃取液料比3個(gè)因素及其相互作用對(duì)茶皂素溶出率及純度的影響，得出最佳提取工藝：萃取pH為4.50、萃取溫度84 ℃、萃取液料比10.60 mL/g，在該條件下，茶皂素溶出率為(92.38±0.57)%，茶皂素純度為(78.47±0.37)%。與傳統(tǒng)提取方法相比，正丁醇/水復(fù)合溶劑萃取茶皂素的提取率顯著提高，碳水化合物等難分離物質(zhì)顯著減少，有利于茶皂素的進(jìn)一步純化利用。