姚廣哲，馬文娟，賈 琪，歐陽慧子，常艷旭，何 俊?

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

東北苦菜為菊科苦苣菜屬植物變色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。在2015 年第20 號(hào)公告中，吉林省食品藥品監(jiān)督管理局將1977 年版《吉林省藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中的北敗醬修訂為東北苦菜［1］。東北苦菜味苦、性寒，具有清熱解毒、清癰、化瘀排膿等功效，臨床上常用于腸炎、急性咽炎、產(chǎn)后瘀血腹痛、急性細(xì)菌性痢疾等疾病的治療［2-4］。據(jù)相關(guān)報(bào)道［5-6］，東北苦菜中主要含有黃酮類、多糖類、揮發(fā)油和有機(jī)酸類等成分，但僅測定單一成分（綠原酸）的含有量，并不能有效的對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，需要建立高效、快速的分析檢測方法，以便能夠更加全面的評(píng)價(jià)東北苦菜藥材的質(zhì)量。

中藥指紋圖譜是能夠標(biāo)示化學(xué)成分特征的色譜圖，其中潛藏著大量數(shù)據(jù)和變量，對(duì)其進(jìn)行挖掘和評(píng)價(jià)，可以有效的反映出中藥內(nèi)在的化學(xué)成分信息。但目前對(duì)中藥成分的處理僅使用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，存在一定的弊端，不能多層次、全方面地對(duì)藥材進(jìn)行整體分析，很難準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)藥材的內(nèi)在真實(shí)質(zhì)量［7-8］?；瘜W(xué)模式識(shí)別方法能對(duì)中藥指紋圖譜信息進(jìn)行深入分析，快速篩選出需要重點(diǎn)關(guān)注的標(biāo)志性成分，能有效的彌補(bǔ)指紋圖譜評(píng)價(jià)方法中的不足，將二者有機(jī)結(jié)合，對(duì)中藥的質(zhì)量在整體性的基礎(chǔ)上得以有效的控制，更快速的識(shí)別出中藥復(fù)雜成分信息，達(dá)到區(qū)分藥物質(zhì)量差異的目的［9-10］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法建立東北苦菜指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，判斷結(jié)果能直觀地反映不同產(chǎn)地樣品之間的質(zhì)量差異，以期為東北苦菜藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供參考。

1 材料

Agilent1290 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Milli-Q 超純水制備儀（天津信睿生物科技有限公司）；AS 60/220.R2 型天平（十萬分之一，蘇州培科實(shí)驗(yàn)室儀器科技有限公司）；G3KT18273型旋渦混合器（賽默飛世爾科技公司）；5424R 型高速控溫離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)MUST-18030620）、異槲皮苷（批號(hào)MUST-17051005）、木犀草苷（批號(hào) MUST-17121210）、木犀草素（批號(hào)MUST-17102605）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡酸（批號(hào)110885-200102）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇（色譜純，美國賽默飛世爾科技公司）；超純水由Milli-Q 制備。

東北苦菜采自吉林省不同地區(qū)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)何俊研究員鑒定為菊科苦苣菜屬植物變色苦菜Ixeris vesicolorDC.的干燥全草。藥材經(jīng)粉碎后，過3 號(hào)篩，保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CORTECS C18柱（2.1 mm ×150 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，90%～81.5% A；8～20 min，81.5%～81.3% A；20～25 min，81.3%～81.3% A；25～35 min，81.3%～60% A；35～40 min，60%～40%A；40～50 min，40%～25%A）；體積流量0.1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測波長 1～15 min，327 nm；15～50 min，360 nm。

2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱定對(duì)照品（綠原酸、木犀草素、異槲皮苷、木犀草苷、咖啡酸）各5 mg，加甲醇溶解并定容于5 mL 量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的貯備液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取東北苦菜粉末0.1 g，加甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，超聲提?。?00 W，50 kHz）30 min，靜置室溫后，加甲醇補(bǔ)足至刻度線，搖勻，14 000 r/min 高速離心10 min，吸取上清液，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，于4 ℃冰箱保存待用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取樣品S4 6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積RSD 達(dá)到規(guī)定要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品S4 6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積RSD 達(dá)到規(guī)定要求，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)樣品S4 供試品溶液進(jìn)行精密吸取，在“2.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣，測得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積RSD 達(dá)到規(guī)定要求，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 指紋圖譜建立及相似度分析 使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)所得的不同批次藥材的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S4 為參照色譜圖，采用多點(diǎn)校正法建立指紋圖譜［11］，得到10 個(gè)東北苦菜指紋圖譜見圖1，從該軟件分析得出，10 批東北苦菜樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（R）的相似度均在0.953 以上。結(jié)果表明，各產(chǎn)地的東北苦菜指紋圖譜具有較高的一致性。相似度分析結(jié)果見表2。

2.5.2 色譜峰指認(rèn) 本研究根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定特征指紋峰，通過對(duì)照品對(duì)各共有色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，最終共確認(rèn)了5 個(gè)色譜峰，分別為2 號(hào)峰（綠原酸）、3 號(hào)峰（咖啡酸）、11 號(hào)峰（異槲皮苷）、12 號(hào)峰（木犀草苷）、19 號(hào)峰（木犀草素），結(jié)果見圖2。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 10 批樣品相似度Tab.2 Similarities of ten batches of samples

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.6 化學(xué)模式識(shí)別方法

2.6.1 聚類分析 本研究應(yīng)用SPSS 24.0 軟件，以共有峰的相對(duì)峰面積為變量，對(duì)東北苦菜樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，方法為組間平均連接法，度量標(biāo)準(zhǔn)為歐氏距離［12］，結(jié)果見圖3。當(dāng)距離刻度為25 時(shí)，10 批樣品主要分為2 大類，S9 為第1 類，S10、S3、S4、S7、S1、S8、S5、S6、S2 為 第2 類。

圖3 10 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of ten batches of samples

2.6.2 主成分分析 本研究中的變量為指紋圖譜中所得到的共有峰的峰面積，以此構(gòu)建10×19 的原始數(shù)據(jù)矩陣，并使用變量統(tǒng)計(jì)分析軟件（SIMCA14.1）對(duì)10 批東北苦菜樣品進(jìn)行主成分分析，Par 作為標(biāo)度化方式，繪制出主成分分析圖，見圖4。結(jié)果表明，不同批次的東北苦菜樣品呈現(xiàn)出明顯的分類，證實(shí)了聚類分析的結(jié)果。圖5表明，載荷圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示為一個(gè)色譜峰，其與原點(diǎn)（0，0）距離的遠(yuǎn)近，代表該色譜峰對(duì)樣品整體分布貢獻(xiàn)程度的大?。?3-14］。2 號(hào)、12 號(hào)和13 號(hào)色譜峰在坐標(biāo)系中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，表明其對(duì)東北苦菜藥物的整體質(zhì)量起到了重要影響作用。

圖4 10 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for ten batches of samples

圖5 10 批樣品主成分分析載荷圖Fig.5 Load scatter diagram of ten batches of samples

2.6.3 正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）本研究采用有監(jiān)督的OPLS-DA 模型進(jìn)一步對(duì)樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各批次樣品間的差異性成分，見圖6。由模型分析驗(yàn)證參數(shù)可知，結(jié)實(shí)率參數(shù)R2X 為0.871，區(qū)分參數(shù)R2Y 為0.984，預(yù)測參數(shù)Q2 為0.748，以上數(shù)據(jù)均大于0.5，表明模型穩(wěn)定并且具有較好的預(yù)測準(zhǔn)確性［15］。為進(jìn)一步篩選出對(duì)上述樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分，本研究以變量投影重要度（Variable Importance for the Projection，VIP）＞1.0 為篩選標(biāo)準(zhǔn)［16］，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。共得到3 個(gè)有意義變量，按照變量投影重要度值大小依次為2 號(hào)峰（綠原酸）＞12 號(hào)峰（木犀草苷）＞13 號(hào)峰，見圖7。這些成分是10 批樣品之間產(chǎn)生差異的主要原因，具有一定的標(biāo)志性作用，該結(jié)果與主成分分析中載荷圖的分析結(jié)果一致。為了更加全面、高效地評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量，在以后對(duì)東北苦菜的研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注上述成分的質(zhì)量變化。

圖6 10 批樣品OPLS-DA 分析散點(diǎn)圖Fig.6 Scatter diagram of OPLS-DA of ten batches of samples

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)東北苦菜藥材進(jìn)行全波長DAD 檢測器掃描，比較不同波長下的圖譜信息發(fā)現(xiàn)，綠原酸在360 nm 處的吸收值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于327 nm 處，其他成分在360 nm 均有較好的吸收值，為了不影響各成分的紫外檢測，且滿足各成分在最大吸收波長范圍內(nèi)均有穩(wěn)定的紫外吸收，因此，選用327、360 nm為檢測波長［17-18］。建立了東北苦菜的UPLC指紋圖譜，并對(duì)10 批樣品進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示10 批樣品相似度均在0.953 以上；圖譜中有19 個(gè)共有峰，標(biāo)定了5 個(gè)化合物，經(jīng)指認(rèn)為綠原酸、咖啡酸、異槲皮素、木犀草苷、木犀草素。

圖7 10 批樣品各成分VIP 圖Fig.7 VIP diagram of various constituents from ten batches of samples

為了改進(jìn)相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)處理的不足，采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以更加客觀的評(píng)價(jià)中藥真?zhèn)闻c優(yōu)劣［19-20］。本實(shí)驗(yàn)采用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)和化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)不同產(chǎn)地的東北苦菜進(jìn)行研究，3 種分析結(jié)果相互驗(yàn)證，系統(tǒng)地闡明東北苦菜藥材內(nèi)在質(zhì)量特征，以期為今后其質(zhì)量控制提供參考。