宋麗麗，聞格，霍姍浩，胡曉龍,2，楊旭，張志平

1(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450001) 2(河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后創(chuàng)新實踐基地，河南 三門峽，472000)

纖維素在自然界中來源豐富且分布廣泛，是地球上數(shù)量巨大的可再生資源。工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中常產(chǎn)生大量的纖維質(zhì)廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、白酒酒糟、食品加工廢棄物、林業(yè)加工下腳料等，但這部分資源并沒有得到合理有效的利用，不僅造成極大的資源浪費而且產(chǎn)生環(huán)境污染等問題。利用微生物生產(chǎn)的纖維素酶，將植物性纖維原料轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食品和化工原料，對解決全球能源危機、食品和飼料資源緊張以及緩解環(huán)境問題等有著重大意義[1]。纖維素酶是一類多酶復合體，主要由內(nèi)切型葡萄糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶3大類具有不同催化反應功能的酶組成[2]。自然界中能產(chǎn)纖維素酶的微生物種類繁多，主要包括真菌、放線菌和部分酵母菌、細菌等[3]。長期以來，高產(chǎn)菌株缺乏一直是制約纖維素酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸，因此篩選得到優(yōu)良的菌株是實現(xiàn)纖維素酶批量生產(chǎn)的關(guān)鍵[4]。

我國是白酒生產(chǎn)大國，酒糟是白酒釀造中數(shù)量最大的副產(chǎn)物，其主要成分是纖維素和木質(zhì)素，同時含有部分蛋白質(zhì)、淀粉和粗脂肪等[5]。新鮮酒糟具有水分含量高、酸度大、有機質(zhì)含量高等特點，由于纖維質(zhì)及有機酸含量較高，生物利用度較低[6-7]，若不及時處理極易腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染及資源浪費。白酒酒糟中纖維素的降解轉(zhuǎn)化對于酒糟的綜合利用具有潛在的經(jīng)濟價值，實現(xiàn)酒精資源的綜合利用將有助于白酒企業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。白酒的固態(tài)釀造具有開放式生產(chǎn)、多菌種共發(fā)酵的特點，其發(fā)酵副產(chǎn)物中含有豐富的微生物資源。曾林等[8]從白酒黃水中篩選得到18株產(chǎn)纖維素酶的菌株。其中SW02被鑒定為植物內(nèi)生芽孢菌(Bacillusendophyticus)，其濾紙酶活力為30.48 U/mL。董丹等[9]從白酒酒糟中篩選出3株高產(chǎn)纖維素酶菌株，經(jīng)鑒定分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。由于細菌纖維素酶活力不如真菌，前期研究多集中于真菌源纖維素，如曲霉、木霉、白耙齒菌等[10-12]，但細菌源纖維素酶具有耐酸堿性、耐熱性、生產(chǎn)周期短、易于培養(yǎng)等優(yōu)點[13-14]。因此，對產(chǎn)纖維素酶細菌的篩選研究仍然具有重要的意義。

筆者從白酒酒糟中篩選到1株產(chǎn)纖維素酶的細菌，對其進行形態(tài)觀察、分子生物學鑒定和生理生化鑒定，并進一步研究其酶學特性，為進一步研究細菌纖維素酶生產(chǎn)菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白酒酒糟：采集于河南省某知名白酒企業(yè)。

1.1.2 試劑

葡萄糖、MgSO4、牛肉膏、蛋白胨、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)等常規(guī)生化試劑,上海國藥集團。羧甲基纖維素(carboxy methyl cellulose，CMC)、微晶纖維素、剛果紅、4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG),美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)篩選培養(yǎng)基(剛果紅培養(yǎng)基)(g/L)：KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.5、酵母粉0.4、瓊脂16.0、剛果紅0.2、CMC 10，121 ℃滅菌20 min。

(2)種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨 5、葡萄糖5、NaCl 5，121 ℃滅菌20 min。

(3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO42、(NH4)2SO41.4、蛋白胨1、尿素0.3、CaCl20.34、MgSO4·7H2O 0.3、FeSO4·7H2O 0.005、MnSO40.001 6、ZnSO4·7H2O 0.001 4、CoCl20.002、CMC 10，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-100H往復式恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DMEX30生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；UV7504紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一生物科技有限公司；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；C1000聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國伯樂公司；GelK8160凝膠成像系統(tǒng)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株初篩

稱取10 g白酒酒糟混懸于100 mL無菌水中，置于磁力攪拌器充分混勻，取懸濁液稀釋為10-3、10-4和10-53個梯度，各稀釋梯度取100 μL涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值大的菌株進行復篩。

1.3.2 菌株復篩

將初篩的菌株純化，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，以2%的接種量接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液,測定粗酶液纖維素酶活力。

纖維素酶酶活力的測定：采用DNS法測定粗酶液酶活力[15]，取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL體積分數(shù)1%的CMC緩沖液(pH 4.8, 0.1 mol/L)，50 ℃反應30 min，加入2 mL DNS 沸水浴中顯色10 min，540 nm測定吸光度。酶活力的定義為：每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態(tài)觀察

將菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體平板上觀察菌落形態(tài)特征。通過革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。

1.3.3.2 分子生物學鑒定[16]

基因組DNA試劑盒提取目的菌株總DNA，采用細菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI上用Blast進行同源檢索，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3.3 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[17]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]進行生理生化特征鑒定。包括V-P試驗、產(chǎn)吲哚試驗、糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗等。

1.3.4 菌株纖維酶素酶學性質(zhì)分析

1.3.4.1 最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性

最適作用溫度：將酶液在不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃)條件下與體積分數(shù)1% CMC進行酶促反應，DNS法測定CMC酶活力。溫度穩(wěn)定性：先將粗酶液置于30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃的水浴鍋中分別孵育30 min，然后進行酶促反應，DNS法測定殘余CMC酶活力。以最高酶活為100%，其他酶活則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.2 最適作用pH及pH穩(wěn)定性[19]

最適作用pH：將CMC酶活測定反應體系pH值分別調(diào)整至pH 3.0～8.0，測定纖維素酶在不同pH條件下的CMC酶活。pH穩(wěn)定性：將粗酶液分別置于于pH 3.0～8.0反應體系中，50 ℃保溫30 min，然后進行酶促反應，DNS法測定殘余CMC酶活力。以最高酶活為100%，其他酶活力則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.3 金屬離子對酶活力的影響

將終濃度為1 mmol/L的金屬離子Cu2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、K+、Ba2+分別添加至酶活力測定體系中，以不添加任何金屬離子組做對照(CK)，測定不同濃度各金屬離子對酶活力的影響。以最高酶活力為100%，其他酶活則換算成相對于最高活力的百分比。

1.3.4.4 底物特異性

將粗酶液加入到以微晶纖維素(1%)、濾紙條(50 mg)、CMC(1%)和pNPG(0.5%)為底物的反應體系中，按前述測酶活的方法，在最適溫度和最適pH條件下反應30 min(濾紙條為底物的體系反應60 min)，測定其在不同底物體系中粗酶液的活力。以最高酶活為100%，其他酶活力則換算成相對于最高活力的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和Origin Pro 9.0進行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶細菌的分離篩選

剛果紅可以與纖維素形成紅色的復合物，當纖維素被降解后，培養(yǎng)基會形成以菌落為中心的水解圈，根據(jù)水解圈(D)與菌落直徑(d)比以及水解圈的清晰程度可初步篩選出具有降解纖維素能力的菌株[20]。從白酒酒糟中共篩選出28株產(chǎn)纖維素酶細菌，以H/C值>8作為初篩標準，選取16株產(chǎn)纖維素酶能力較高的菌株，如表1所示。

表1 16株菌在剛果紅平板的透明圈直徑

注：“++++”為透明圈清晰可見；“+++”為透明圈較清晰；“++”為透明圈渾濁

其中YS21-4、YS19-6、YS9-2、YS10-2、YS13-2五株菌的D/d>10，且透明圈清晰，對CMC降解性能較好，菌株YS32-9雖然水解圈直徑較大，但菌落本身直徑也比較大，因此D/d值僅為8.8。由于菌株在剛果紅培養(yǎng)基上水解圈的大小與實際產(chǎn)酶能力不一定呈現(xiàn)一致的關(guān)系[21]，因此將初篩得到的16株菌進行進一步的發(fā)酵產(chǎn)酶復篩。

將初篩得到的16株細菌進行發(fā)酵產(chǎn)酶復篩，酶活見表2。其中菌株YS10-2胞外酶活力最高，為(36.73±2.45)U/mL，且在剛果紅平板上產(chǎn)生清晰的透明圈(圖1)，因此將YS10-2作為出發(fā)菌株，進行下一步的研究。

表2 16株菌產(chǎn)纖維素酶活力測定

A-對照菌株;B-纖維素酶產(chǎn)生菌YS10-2

2.2 菌株YS10-2的鑒定

2.2.1 菌株YS10-2的形態(tài)學特征

如圖2所示，菌株YS10-2在牛肉膏蛋白胨平板上菌落形態(tài)為乳白色，近圓形，表面較濕，富有光澤，不透明，顯微鏡下菌體呈桿狀，有芽孢，革蘭氏染色為陽性。

2.2.2 菌株YS10-2分子生物學鑒定

a-菌落形態(tài)；b-菌株形態(tài)

以菌株YS10-2總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，檢驗得到約為1.5 kb條帶(圖3)，將目的菌株的16S rDNA序列和該屬有代表性細菌的16s rDNA序列構(gòu)建的遺傳進化樹，如圖4所示。菌株YS10-2的16S rDNA 基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，為芽孢桿菌屬，與Bacillusmegaterium同源性最高，達到100%，判斷菌株YS10-2 屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。研究表明，芽孢桿菌做為益生菌具有促進機體消化吸收和增強免疫力的作用[22]，因此在酒糟再利用轉(zhuǎn)化為飼料方面具有應用潛力。

M-marker

圖4 基于16S rDNA序列菌株YS10-2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 菌株YS10-2生理生化鑒定

對菌株YS10-2進行生理生化鑒定，結(jié)果如表3。菌株YS10-2具有水解淀粉、吲哚陰性、接觸酶陽性及發(fā)酵糖產(chǎn)酸生理生化特性[17]，與巨大芽孢桿菌屬特征一致。

表3 菌株YS10-2的生理生化鑒定結(jié)果

注：-代表陰性結(jié)果，+代表陽性結(jié)果

2.3 纖維素酶酶學性質(zhì)研究

2.3.1 纖維素酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

考察不同溫度(30～70℃)對纖維素酶活性的影響，結(jié)果如圖5所示。YS10-2胞外粗酶液最適反應溫度為50 ℃，在40～55 ℃溫度范圍內(nèi)，其酶活力在80%以上，高于60 ℃，酶活力逐漸下降，當反應溫度為70 ℃時，酶活力降至50%。

圖5 溫度對纖維素酶活力的影響

纖維素粗酶液經(jīng)30～70 ℃處理30 min后，其酶活力變化情況如圖6所示。纖維素酶在30～55 ℃酶活均保持穩(wěn)定(>80%)，當溫度高于60 ℃時，酶活力穩(wěn)定性下降，70 ℃時，相對酶活力為50%，仍保持有一定的酶活力，說明菌株YS10-2所產(chǎn)的纖維素酶具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 纖維素酶最適pH及pH穩(wěn)定性

如圖7所示，50 ℃條件下纖維素酶最適作用pH值為5.0，pH在4.0～5.5范圍內(nèi)，纖維素酶的酶活在90%左右，該酶最適作用pH為弱酸性，當pH>6.0，酶活迅速下降，pH為8.0時，酶活力僅剩余20%，說明該酶不耐堿性條件。

圖6 纖維素酶熱穩(wěn)定性

圖7 不同pH值對纖維素酶活力的影響

考察菌株YS10-2胞外粗酶液在不同pH條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8所示，該酶在pH 4.0～5.5范圍內(nèi)，酶活力穩(wěn)定在90%以上，當pH<3.5或pH>6.0時，其酶活力損失較多，穩(wěn)定性變差，該酶在弱酸性條件下相對比較穩(wěn)定。

圖8 不同pH值下纖維素酶的穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子對纖維素酶活性的影響

考察不同金屬離子對纖維素酶活性的影響，以不添加任何金屬離子作為空白對照，由圖9可知，金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+是該酶的激活劑，酶活力分別增加28%、12%和26%，而Cu2+和Ba2+是該酶的抑制劑，添加后酶活力分別下降50%和60%，其他離子添加則對纖維素酶活力無顯著影響(P>0.05)。

圖9 不同金屬離子對纖維素酶活力的影響

2.3.4 纖維素酶最適作用底物

分別以CMC、微晶纖維素、濾紙、pNPG為底物測定YS10-2粗酶液的活力，如圖10所示，該酶對CMC的降解效果最好，其次為濾紙，對pNPG的降解性較差。纖維素酶為一種復合酶，主要是由葡聚糖外切酶、葡聚糖內(nèi)切酶及β-葡萄糖苷酶組成[2]。CMC主要評價葡聚糖內(nèi)切酶活力，微晶纖維素主要評價葡聚糖外切酶活力，pNPG為β-葡萄糖苷酶的水解底物[23-24]，通過對比不同底物降解性試驗，YS10-2所產(chǎn)胞外酶以葡聚糖內(nèi)切酶為主，對CMC的降解具有一定的底物特異性，同時濾紙酶活力也較高。

圖10 纖維素酶對不同底物的水解活力

白酒釀造環(huán)境蘊含豐富的纖維素降解菌資源[25]，研究表明芽孢桿菌屬優(yōu)勢菌，如植物內(nèi)生芽孢桿菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、解淀粉芽孢桿菌[21]等，芽孢桿菌具有耐酸、耐堿、耐高溫等顯著優(yōu)勢，作為益生菌，具有促進機體消化吸收等功效[22,26]。本研究篩選得到的YS10-2為巨大芽孢桿菌，對白酒釀造環(huán)境中芽孢桿菌屬纖維素降解菌資源是重要的補充。菌株YS10-2的纖維素酶活與現(xiàn)在報道的從白酒釀造環(huán)境篩選得到的芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活相當[8-9,21,25]，對結(jié)構(gòu)類似于天然纖維素的濾紙也有較高的酶活力，表明該菌株對白酒酒糟纖維質(zhì)資源轉(zhuǎn)化利用具有應用潛力。

3 結(jié)論

本研究從白酒酒糟中篩選出1株纖維素酶菌株YS10-2，其CMC酶活力為(36.73±2.45)U/mL，經(jīng)形態(tài)學觀察、分子生物鑒定及生理生化鑒定其為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。對菌株YS10-2所產(chǎn)纖維素酶酶學性質(zhì)研究表明，其最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH為5.0，在30～55 ℃，pH為4.0～5.5范圍內(nèi)，纖維素酶的穩(wěn)定性較高。金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+是該酶的激活劑，而Cu2+和Ba2+則對酶活有抑制作用，該酶的最適反應底物為CMC，對濾紙的降解效果也較好。本研究為產(chǎn)纖維素酶菌株資源的開發(fā)利用提供補充，以期為白酒酒糟的綜合利用提供參考。