陳章捷

摘要? ? 對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21316—2007測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定。根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019）中的規(guī)定，建立測(cè)定鰻魚肉中磺胺殘留量測(cè)定的數(shù)學(xué)模型，根據(jù)測(cè)量不確定度的來(lái)源，以磺胺甲基嘧啶為例，對(duì)各個(gè)不確定度分量進(jìn)行評(píng)定和分析。評(píng)定結(jié)果表明，當(dāng)樣品磺胺甲基嘧啶含量檢測(cè)結(jié)果為10.4 μg/kg時(shí)，擴(kuò)展不確定度為3.4 μg/kg。不確定度按照從大到小排列，依次為標(biāo)準(zhǔn)曲線最小二乘法擬合、測(cè)量重復(fù)性、回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備、LC/MS/MS定量重復(fù)性、樣品定容、樣品稱量。

關(guān)鍵詞? ? 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn);GB/T 21316—2007;動(dòng)物源性食品;磺胺;不確定度評(píng)定

中圖分類號(hào)? ? S859.84? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

Abstract? ? The uncertainty of determination of sulfonamide residues in animal-derived foods by GB/T 21316-2007 was evaluated.According to "Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement"（JJF 1059.1-2012）and "Guidance on Quantifying Uncertainty in Chemical Analysis"（CNAS-GL006：2019），a mathematical model for determination of sulfonamide residues in eel meat was established.Based on the sources of the measurement uncertainty，each uncertainty of sulfamethazine as an example was evaluated and analyzed.The evaluation results showed that the extended uncertainty was 3.4 μg/kg when the test result of sulfamethazine content in samples was 10.4 μg/kg.The uncertainty was arranged in order from large to small，which were least squares calibration，measurement repeatability，recovery rate，standard solution preparation，LC/MS/MS quantitative repeatability，sample volume determination and sample weighing.

Key words? ? national standard;GB/T 21316-2007;animal-derived food;sulfonamide;uncertainty evaluation

磺胺類藥物是以對(duì)位氨基苯磺酰胺（簡(jiǎn)稱磺胺）為基本結(jié)構(gòu)的一類人工合成抗生素的總稱，具有抗菌譜廣、吸收迅速、使用方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和畜牧行業(yè)。然而，磺胺類藥物在動(dòng)物體中使用也會(huì)產(chǎn)生藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)。這類藥物會(huì)造成排尿、造血紊亂等副作用和過(guò)敏反應(yīng)，人類若大量攝入將對(duì)健康造成危害[1-7]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告明確規(guī)定，在動(dòng)物肌肉、脂肪、肝、腎及牛羊奶中，磺胺類藥物殘留總量不得超過(guò)100 μg/kg。國(guó)際食品法典委員會(huì)、美國(guó)、日本、歐盟均對(duì)食品中磺胺類藥物規(guī)定了最高殘留限量[1-3，6-7]。

《動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（GB/T 21316—2007）[8]是國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢指定的動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。由于監(jiān)督抽檢結(jié)果關(guān)乎被抽檢的食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者切身利益，需要對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定度開展評(píng)定，以評(píng)價(jià)抽檢結(jié)果的準(zhǔn)確度。采用該國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)市售鰻魚樣品進(jìn)行磺胺殘留量測(cè)定，然后依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]的基本要求，并參考《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019）[10]（該指南等同采用EURACHEM發(fā)布的《Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement》[11]）的評(píng)估方法，對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行了不確定度評(píng)定，以期為食品監(jiān)督抽檢機(jī)構(gòu)和檢測(cè)人員在檢測(cè)磺胺類藥物殘留過(guò)程中提供技術(shù)參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 主要儀器與試劑

XEVO TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）;XSE204電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）;Milli-Q IQ 7000超純水機(jī)（美國(guó)默克集團(tuán)）;移液器（20～200、100～1 000 μL，美國(guó)艾本德公司;CR22N高速冷凍離心機(jī)（日本日立集團(tuán)）;RE80旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本雅馬拓科學(xué)公司）;KQ-1500DE超聲波清洗儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

100 μg/mL磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GB/T 21316規(guī)定的23種，德國(guó)Pharma公司）;乙腈、正己烷、正丙醇、甲酸（均為色譜純，賽默飛世爾科技公司）。

1.2? ? 樣品處理

將鰻魚制成糜樣，稱取2 g置于50 mL離心管，加入6 g C18填料，使樣品與填料混合均勻，加入25 mL乙腈-水（1 000∶30）溶液旋渦振蕩1 min，微波爐光波模式下輻照30 s，3 000 r/min離心5 min，將乙腈層移入100 mL棕色分液漏斗，離心后的沉淀物加25 mL乙腈提取30 s，3 000 r/min離心5 min，合并乙腈提取液。在提取液中加入25 mL乙腈飽和正己烷，振搖5 min，將底層乙腈移入150 mL雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃減壓蒸發(fā)近干，氮?dú)饬鞔蹈?。加? mL乙腈水溶液（1∶1），超聲30 s溶解殘?jiān)?，將溶解液移?0 mL離心管，加0.5 mL乙腈飽和正己烷，振蕩2 min，3 000 r/min離心5min，棄去正己烷，取底層乙腈水溶液過(guò)0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3? ? 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC@BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸。梯度洗脫程序?yàn)?～0.2 min，2%A;0.2～3.0 min，2%A加至30%A;3.0～4.0 min，30%A加至70% A;4.0～6.0 min，70%A加至95%A;6.0～6.1 min，95%A減至2%A;6.1～7.0 min，2%A;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量1 μL;流速0.2 mL/min。

1.4? ? 質(zhì)譜條件

電離模式為ESI+;監(jiān)測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;電噴霧電壓5 500 V;霧化氣壓力0.065 MPa;氣簾氣壓力0.016 MPa;輔助氣壓力0.060 MPa;離子源溫度475 ℃。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞電壓和去簇電壓參照GB/T 21316—2007中質(zhì)譜測(cè)定參考條件設(shè)置。

1.5? ? 測(cè)定

用空白基質(zhì)配備標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，濃度為20、40、60、80、100 ng/mL。按照1.2～1.4方法對(duì)鰻魚樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.6? ? 計(jì)算公式和數(shù)學(xué)模型

樣品中磺胺含量按公式計(jì)算：

式中：x為樣品中磺胺藥物含量單位為μg/kg;c為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的磺胺類藥物的濃度，單位為ng/mL;V為定容體積，單位為mL;m為樣品質(zhì)量，單位為g。

上述計(jì)算公式是從測(cè)量原理給出的，未考慮各種隨機(jī)因素對(duì)不確定度的影響，在此引入反映隨機(jī)影響的重復(fù)性系數(shù)frep。另外，由于樣品前處理過(guò)程較為復(fù)雜，通過(guò)同時(shí)測(cè)定加標(biāo)回收率，引入回收率值R用于校正結(jié)果。評(píng)定不確定度的數(shù)學(xué)模型應(yīng)寫成如下形式：

1.7? ? 識(shí)別和分析不確定度來(lái)源

通過(guò)繪制因果圖來(lái)分析農(nóng)藥定量過(guò)程中的不確定度來(lái)源[12-15]，見圖1。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不確定度分量的計(jì)算（以磺胺甲基嘧啶為例）

2.2? ? 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

2.2.1? ? 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度。磺胺甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書中說(shuō)明其定值為100 μg/mL±3%，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為3%，按正態(tài)分布計(jì)算，k=2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（p）=0.03/2=0.015。

2.2.2? ? 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制引入的不確定度。用20～200 μL移液器移取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100 μL至10 mL容量瓶，配制1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006），200 μL可調(diào)移液器吸取100 μL時(shí)容量允許誤差為 ±2.0%，按均勻分布，100 μL移液器移取體積誤差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（100 μL）=0.012。根據(jù)《常用玻璃量器》（JJG 196—2006），A級(jí)單標(biāo)線10 mL容量瓶允差為±0.020 mL，按三角分布計(jì)算，包含因子為6，則10 mL容量瓶稱量體積誤差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（10 mL）=0.000 82。

2.2.3? ? 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制引入的不確定度。用100～1 000 μL移液器吸取200、400、600、800、1 000 μL的1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶，用空白基質(zhì)配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。查《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006），1 000 μL可調(diào)移液器移取100 μL時(shí)，允差為2.0%，移取500 μL允差為1.0%，移取1 000 μL允差為1.0%。實(shí)際移取200、400 μL時(shí)允差以2.0%計(jì)算，600、800、1 000 μL時(shí)允差以1.0%計(jì)算。按均勻分布，則urel（200 μL）=0.012，urel（400 μL）=0.012，urel（600 μL）=0.005 8，urel（800 μL）=0.005 8，urel（1 000 μL）=0.005 8。10 mL容量瓶稱量體積誤差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（10 mL）=0.000 82。

2.2.4? ? 實(shí)際操作溫度與校正溫度不同引入的不確定度。配制過(guò)程因與校正溫度不同引入的相對(duì)不確定度按下式計(jì)算：

其中，α為液體的體積膨脹系數(shù)，ΔT為溫差。

吸取基質(zhì)為甲醇的母液1次，用乙腈定容1次，吸取基質(zhì)為乙腈的中間液5次，用空白基質(zhì)（主要為1∶1乙腈水溶液）定容5次。α甲醇=0.001 18/℃，α乙腈=0.001 37/℃，α水=0.000 208/℃。α乙腈水溶液=0.5α水+0.5α乙腈=0.000 789/℃，ΔT=±3 ℃。urel（T甲醇）=0.002 04，urel（T乙腈）=0.002 37，urel（T乙腈水溶液）=0.001 37。因此，urel（Ts）=0.006 67。

2.2.5? ? 合成標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度。

2.3? ? 樣品定容引入的不確定度

用100～1 000 μL移液器吸取1 mL乙腈水溶液溶解殘?jiān)埔浩髟什顬?.0%，按均勻分布，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Vm）=0.005 8。移液器移取時(shí)的溫度與校正溫度的差異引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（T）=0.001 37。因此，樣品定容步驟引入的不確定度為urel（V）=0.006 0。

2.4? ? LC/MS/MS 儀器測(cè)定帶來(lái)的不確定度

計(jì)量證書上定量重復(fù)性為1%，按均勻分布，儀器定量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（LCMSMS）=0.007 1。

2.5? ? 最小二乘法擬合引入的不確定度

采用空白基質(zhì)配制5種濃度標(biāo)液，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定1次，測(cè)定數(shù)據(jù)見表1。通過(guò)線性擬合得回歸方程y=20 757.730 15x-5.922 04×104，相關(guān)系數(shù)為0.997 87，方程顯著有效（α=5%）。

回歸直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差按下式計(jì)算：

其中，yij為儀器各點(diǎn)響應(yīng)值;n為測(cè)量點(diǎn)數(shù)目;m為每個(gè)測(cè)量點(diǎn)重復(fù)測(cè)定次數(shù);為回歸直線計(jì)算的峰面積值。n=5，m=1，計(jì)算Sy/x=44 713。

擬合帶來(lái)的不確定度用下式計(jì)算：

其中，B為回歸曲線斜率，P為測(cè)試樣品次數(shù)，n為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)（總次數(shù)），x為未知樣的進(jìn)樣濃度，xi為標(biāo)準(zhǔn)曲線每一點(diǎn)的濃度值，x為標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的平均值。計(jì)算得u（c）=2.7。

對(duì)鰻魚樣品進(jìn)行一次測(cè)定，通過(guò)回歸曲線計(jì)算樣品最后進(jìn)樣濃度為20.7 μg/mL，故最小二乘法擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（c）=2.7/20.7=0.13。

2.6? ? 測(cè)量重復(fù)性帶來(lái)的不確定度（A類評(píng)定）

考慮到同一檢測(cè)人員在固定的操作環(huán)境下嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)方法對(duì)樣品開展測(cè)定，測(cè)量系統(tǒng)穩(wěn)定，根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），可通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行10次獨(dú)立測(cè)定，預(yù)先評(píng)估單個(gè)測(cè)定值的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

10次測(cè)定結(jié)果依次為x1=10.3 μg/kg、x2=11.5 μg/kg、x3=10.5 μg/kg、x4=9.72 μg/kg、x5=9.91 μg/kg、x6=11.6 μg/kg、x7=10.8 μg/kg、x8=9.93 μg/kg、x9=9.79 μg/kg、x10=11.6 μg/kg，平均值x=10.6 μg/kg，測(cè)量次數(shù)n=10。單次測(cè)量的試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差S（xk）=0.767。

實(shí)際測(cè)定時(shí)只測(cè)定1次，n′=1，測(cè)定值為10.4 μg/kg，故單次測(cè)量值的A類相對(duì)不確定度為：

2.7? ? 回收率帶來(lái)的不確定度

用空白鰻魚樣品以10 μg/kg濃度進(jìn)行6次加標(biāo)回收測(cè)試，回收率結(jié)果見表2。

經(jīng)計(jì)算，平均回收率（R）為89.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S（R）為0.087 5，平均回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（R）=0.035 7。根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019）中偏倚研究的方法，可用t檢驗(yàn)來(lái)確定平均回收率R是否與100%有顯著性差異：檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t=2.93;而95%置信度，n-1自由度下的雙側(cè)臨界值t（0.05，5）=2.571，t>t（0.05，5），故R與100%有顯著性差異，需要進(jìn)行回收率校正。回收率校正帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（R）=0.040。

2.8? ? 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

試樣中磺胺甲基嘧啶含量x的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算如下：

3? ? 結(jié)論與討論

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21316—2007對(duì)鰻魚肉中磺胺類藥物殘留量進(jìn)行測(cè)定，并以磺胺甲基嘧啶為例，給出了檢測(cè)結(jié)果的不確定度評(píng)定示范，為相關(guān)食品安全監(jiān)督抽檢報(bào)告的結(jié)果提供了可靠性評(píng)估依據(jù)。另外，通過(guò)比較不確定度各個(gè)分量的值，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定度影響程度不同;影響最大的是標(biāo)準(zhǔn)曲線最小二乘法擬合和測(cè)量重復(fù)性，其余因素按照從大到小依次為回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備、LC/MS/MS定量重復(fù)性、樣品定容、樣品稱量。因此，檢測(cè)人員按該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)、增加標(biāo)準(zhǔn)溶液系列點(diǎn)數(shù)和增加實(shí)際樣品平行測(cè)定次數(shù)等手段，減少標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合和測(cè)量重復(fù)性所引入的不確定度，從而減少最終檢測(cè)結(jié)果的不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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