柴志欣，王 會(huì)，王吉坤，王嘉博，鐘金城

(西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是中亞帕米爾高原的特有家畜，是高原地區(qū)主要的畜種資源和牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要基礎(chǔ)。然而牦牛的生長(zhǎng)速度慢，成熟期晚，產(chǎn)乳、產(chǎn)肉等生產(chǎn)性能較低。為提高牦牛的經(jīng)濟(jì)效益，將牦牛與普通牛進(jìn)行種間雜交改良，雜種F1犏牛產(chǎn)肉量、產(chǎn)奶量均有提高，雜種優(yōu)勢(shì)顯著。但F1公犏牛因生精機(jī)能紊亂表現(xiàn)為不育，而母犏?？捎蛊潆s種優(yōu)勢(shì)的利用和牦牛優(yōu)良遺傳資源的研究受到限制。而犏牛雄性不育的最終表現(xiàn)是精子發(fā)生受阻[1-3]。犏牛雄性不育是物種間生殖隔離的表現(xiàn)之一，其形成機(jī)制應(yīng)與精子發(fā)生、物種生殖隔離和分化相關(guān)，而基因或基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致基因功能的異常應(yīng)該是產(chǎn)生這一生殖隔離的主要原因。

睪丸、腦RNA結(jié)合蛋白(Testis brain RNA-binding protein，TB-RBP)是一類(lèi)特異性靶向結(jié)合蛋白，可與睪丸、腦組織中的魚(yú)精蛋白1(Prm1)、魚(yú)精蛋白2(Prm2)、激酶A 錨定蛋白4等靶基因mRNA特異結(jié)合。在精子發(fā)育過(guò)程中，TB-RBP主要對(duì)減數(shù)分裂后部分靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，是調(diào)節(jié)精子活力，維持精子正常形態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一。TB-RBP可與mRNA非翻譯區(qū)保守元件特異性結(jié)合來(lái)保持mRNA穩(wěn)定，且在多數(shù)靶基因mRNA-3′(UTR)包含TB-RBP的保守結(jié)合序列。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，基因的表達(dá)水平、基因的網(wǎng)絡(luò)互作對(duì)精子發(fā)育成形，形成成熟、正常有生育能力的精子具有重要作用。而減數(shù)分裂階段是精子發(fā)生的重要過(guò)程，靶基因Akap4可引導(dǎo)蛋白激酶A與磷酸化位點(diǎn)靶向結(jié)合，同時(shí)參與由cAMP介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)精子活力，該基因作為精子纖維鞘組成部分維持其固有形態(tài)[4-5]。

自20世紀(jì)50年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了許多研究，利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法探討牦牛與普通牛遠(yuǎn)緣雜交后代雄性不育與漸進(jìn)可育的遺傳機(jī)理及其規(guī)律，對(duì)最終解決種間雜交雄性不育這一牦牛改良的關(guān)鍵技術(shù)難題具有十分重要的意義。本研究通過(guò)對(duì)精子發(fā)生過(guò)程關(guān)鍵基因TB-RBP進(jìn)行克隆，分析其在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步從分子水平開(kāi)展犏牛雄性不育的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)、pMD19-T載體(TaKaRa)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DEPC 原液及Taq Master Mix(2×)(Thermo)，其他常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集及總RNA提取

在青海省大通種牛場(chǎng)選取6頭健康犏牛(1歲1頭，2歲3頭，3歲2頭)，在四川省九龍縣選取3頭健康成年牦牛(7歲)；去勢(shì)后采集睪丸組織，DEPC水沖洗后迅速放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TRIzol法提取牦牛和犏牛睪丸組織總RNA，置-80 ℃保存或立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用紫外分光光度計(jì)和全自動(dòng)電泳檢測(cè)RNA濃度和純度。

1.3 cDNA第一鏈的合成

以提取睪丸組織總RNA為模板，采用RNA PCR Kit9(AMV)Ver.3.0試劑盒，Oligo-dT為引物，合成cDNA第一條鏈。反應(yīng)條件：45 ℃，45 min；99 ℃，5 min；5 ℃保存。反應(yīng)體系為：MgCl22 μL，10×RT Buffer，dNTP Mixture 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，OligodT-Adaptor Primer 0.5 μL，總RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 3.75 μL。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)資料及NCBI已發(fā)表TB-RBP基因(NM_001076006和XM_001250367)核苷酸序列，采用Primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，送英濰捷基(上海)生物科技有限公司合成，基因克隆及熒光定量引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 PCR擴(kuò)增及RT-PCR反應(yīng)

TB-RBP基因克隆反應(yīng)體系為：MasterMix 25 μL，上下游引物(20 nmoL/μL)各1 μL，cDNA模板4 μL，加去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序，具體見(jiàn)表2。

采用SYBR Green Ⅰ染料法在BIO-RADC10000熒光定量?jī)x上進(jìn)行。以cDNA為模板，反應(yīng)采用25 μL體系：SYBR?Premix Ex Taq(2×)12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、cDNA 2 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序見(jiàn)表2。

表2 PCR 擴(kuò)增程序

1.6 質(zhì)粒提取及酶切鑒定

將已提取的質(zhì)粒DNA用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為：HindⅢ 1 μL，EcoRⅠ 1 μL，1×mol/L Buffer 4 μL，質(zhì)粒DNA 5 μL，去離子水7 μL。37 ℃酶切1 h左右，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)酶切結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度檢測(cè)

采用分光光度法測(cè)定所提總RNA，OD260/280≈2.0，并采用全自動(dòng)電泳儀(BIO-RED)檢測(cè)到明顯的18S、28S和5S條帶及波峰，且18S、28S波峰區(qū)域比值、片段區(qū)域比值、18S與28S的比較結(jié)果及總RNA區(qū)域值和濃度值，都說(shuō)明RNA質(zhì)量較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)獲得TB-RBP基因引物1擴(kuò)增片段為587 bp，引物2擴(kuò)增片段713 bp，條帶清晰明亮，與預(yù)期片段大小一致(圖2)，純化回收后，送公司測(cè)序。

圖1 總RNA電泳圖

A.1引物；B.2引物。1-2.犏牛；3-4.牦牛。

2.3 重組子質(zhì)粒PCR及酶切鑒定

利用藍(lán)白斑遺傳學(xué)篩選法挑取白色單一菌落，置于含Ampr/LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)重組子菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，TB-RBP基因的質(zhì)粒均擴(kuò)增出目的條帶(圖3-A)。初步證明目的基因片段已重組到載體上。

將所提重組質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切消化，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示得到2條片段，分別為2 692 bp的載體序列和目的片段(圖3-B)，證明目的片段已成功克隆，并且可以確定目的片段為正向插入。在圖3中，1、3泳道分別為犏牛TB-RBP引物1、2質(zhì)粒及酶切PCR產(chǎn)物，2、4泳道分別為牦牛TB-RBP引物1、2質(zhì)粒及酶切PCR產(chǎn)物。

圖3 質(zhì)粒PCR(A)及酶切(B)鑒定圖

2.4 TB-RBP基因序列分析

克隆所得牦牛(GenBank上傳序列號(hào) No.：EF432559)TB-RBP基因CDS全序列873 bp，獲得犏牛(GenBank上傳序列號(hào) No.： EF432558)TB-RBP基因部分CDS區(qū)序列587 bp。犏牛同牦牛和GenBank中海福特牛(No.： BC120296)部分CDS序列進(jìn)行比對(duì)(圖4)，結(jié)果表明：牦牛與犏牛序列相比，存在8處堿基突變，一致性為98.6%；牦牛與普通牛序列相比，共有6處發(fā)生堿基變異，一致性為98.4%；犏牛與普通牛序列相比，共有3處發(fā)生堿基變異，一致性為99.2%。

2.5 進(jìn)化樹(shù)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜集13個(gè)物種TB-RBP基因CDS序列，利用MEGA 5.2.2軟件對(duì)牦牛、黃牛、水牛等13個(gè)物種TB-RBP基因CDS區(qū)核苷酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。共聚為兩大類(lèi)，其中九龍牦牛與野牦牛、美洲野牛、犏牛遺傳距離較近，并與普通牛聚為一類(lèi)，印度水牛與其他物種聚為另一大類(lèi)(圖5)，說(shuō)明不同物種TB-RBP基因編碼區(qū)序列高度保守，遺傳相似性較高。

2.6 氨基酸序列理化特性預(yù)測(cè)與分析

利用ExPASy在線分析軟件ProtParam程序?qū)﹃笈B-RBP蛋白編碼氨基酸的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其氨基酸組成見(jiàn)表3。牦牛TB-RBP基因共編碼290個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為33.179 ku，理論等電點(diǎn)pI=7.72，帶負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)總數(shù)為41個(gè)，正電荷殘基(Arg + Lys)總數(shù)為42個(gè)，其中絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)數(shù)量較多，分別為25，24，22個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為45.06，表明此類(lèi)蛋白為不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為79.28，親水性指數(shù)(GRAVY)為-5.550，應(yīng)用ExPASy-ProtScale程序計(jì)算TB-RBP疏水性，蛋白質(zhì)中存在4個(gè)明顯的疏水區(qū)，分別是33-40位，127-145位，184-205位，271-280位，此蛋白為親水性蛋白。而犏牛TB-RBP基因部分CDS區(qū)序列587 bp，編碼193個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為47.521 ku，理論等電點(diǎn)PI=5.20，其中氨基酸組成僅包含Ala(A)34.9%，Cys(C)17.9%，Gly(G)22.8%，The(T)24.4%；不穩(wěn)定指數(shù)41.44，犏牛該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白，與牦牛TB-RBP蛋白性質(zhì)一致；脂肪系數(shù)34.92，GRAVY為0.814，犏牛TB-RBP屬親水性蛋白。

圖4 牦牛、犏牛、普通牛TB-RBP基因核苷酸序列比較

表3 牦牛TB-RBP基因cDNA推測(cè)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2.7 蛋白結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

2.7.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 通過(guò)HNN http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl在線對(duì)TB-RBP氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖6)。

h.α螺旋；c.無(wú)規(guī)則卷曲；e.β折疊。

結(jié)果顯示，在牦牛TB-RBP分子中，存在7個(gè)較為明顯的α螺旋(Hh)富集區(qū)域，共有160處，α螺旋(Hh)含量達(dá)到55.17%；無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)105處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的36.21%；β折疊(Ee)25處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的8.62%。犏牛TB-RBP蛋白α螺旋(Hh)46.11%，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)41.45%，α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要組成結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-MODEL查找與TB-RBP氨基酸序列相似性較高的序列預(yù)測(cè)其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，下載相應(yīng)的PDB模型，利用RasMol軟件對(duì)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè)分析(圖7)。結(jié)果表明，牦牛TB-RBP蛋白含有7個(gè)α-螺旋，為全α型，其結(jié)構(gòu)為平行的α-螺旋/7螺旋束；犏牛TB-RBP蛋白包含5個(gè)α-螺旋，2個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，其結(jié)構(gòu)為環(huán)繞結(jié)構(gòu)束。

圖7 牦牛和犏牛TB-RBP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.7.2 功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析 利用TMHMM預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛TB-RBP無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。用TMPRED軟件分析發(fā)現(xiàn)牦牛TB-RBP包含2個(gè)具有較高可能性的跨膜區(qū)，但只是明顯的TM片段，不存在跨膜蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；犏牛該蛋白也不存在跨膜區(qū)，僅在17-33位包含一個(gè)TM跨膜螺旋。在線工具SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)TB-RBP蛋白信號(hào)肽，結(jié)果表明，TB-RBP蛋白無(wú)信號(hào)肽序列，該蛋白為非分泌型蛋白。利用NetOGlyc 1.0、NetPhos 2.0分別對(duì)TB-RBP蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)TB-RBP蛋白存在6個(gè)賴(lài)氨酸ε氨基糖基化位點(diǎn)(10，80，103，106，183，221)，15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為10個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(9，21，51，83，86，97，109，110，147，207)、3個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(64，125，155)、2個(gè)酪氨酸位點(diǎn)(179，186)。

利用NCBI 中Conserved Domain Search Service(CD Search)預(yù)測(cè)TB-RBP蛋白保守結(jié)構(gòu)域(圖8)。結(jié)果表明，TB-RBP蛋白屬于Translin結(jié)合蛋白家族，其中Translin(TB-RBP)及其結(jié)合蛋白TRAX是一對(duì)旁系同源保守蛋白，TRAX和Translin的寡聚蛋白復(fù)合物形成C3PO(也稱(chēng)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC)，Translin-Trax復(fù)合物可增強(qiáng)RNAi中錯(cuò)義鏈的去除和活性RISC的形成。除RNAi之外，Translin和Trax還參與多種核酸代謝途徑，并涉及廣泛的生物活性，包括mRNA加工、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、精子發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、基因組穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和致癌作用等。

圖8 TB-RBP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果

2.7.3 蛋白質(zhì)功能分析 PSORT Ⅱ Prediction分析發(fā)現(xiàn)，TB-RBP基因編碼的蛋白分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、分泌系統(tǒng)的囊泡和細(xì)胞骨架，其中在細(xì)胞核中分布最多，達(dá)到60.9%，具有核定位信號(hào)的功能。

2.8 牦牛TB-RBP mRNA組織表達(dá)

2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋的5個(gè)濃度(10-3～10-12)作為模板，每個(gè)濃度做至少3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，由擴(kuò)增曲線得到Ct值，由軟件擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)SYBR GREEN 熒光定量PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線(圖9)，TB-RBP基因相關(guān)系數(shù)為0.993，說(shuō)明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性很好。標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值線性圖橫坐標(biāo)代表拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，TB-RBP標(biāo)準(zhǔn)曲線及其擴(kuò)增曲線，在10-2～10-6范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.224x+42.160。

2.8.2 熒光定量RT-PCR結(jié)果 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值，可對(duì)每一樣品初始拷貝數(shù)絕對(duì)定量。牦牛和犏牛睪丸組織每100 ng總RNA中，TB-RBP基因的拷貝數(shù)為4.95×105～7.75×108，TB-RBP基因在犏牛和牦牛的睪丸組織中均有表達(dá)；t檢驗(yàn)表明，TB-RBP基因的表達(dá)量在牦牛與犏牛組間差異顯著(0.01

Ct值與模板量拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值作圖標(biāo)準(zhǔn)曲線(A)；以模板在不同循環(huán)擴(kuò)增時(shí)的熒光強(qiáng)度作圖擴(kuò)增曲線(B)。

圖中標(biāo)有不同字母者為差異顯著(小寫(xiě)字母表示P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

目前，Translin蛋白在非洲爪蟾、小鼠、果蠅、人類(lèi)等物種中均有發(fā)現(xiàn)[6]，是一種進(jìn)化保守且高度同源的蛋白，而TB-RBP是在小鼠睪丸和腦組織中發(fā)現(xiàn)的一種translin蛋白，TB-RBP蛋白在機(jī)體中的調(diào)控作用主要通過(guò)與DNA/RNA的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。在睪丸中，TB-RBP可調(diào)控減數(shù)分裂產(chǎn)生的生殖細(xì)胞mRNA的表達(dá)，同時(shí)對(duì)非編碼RNA轉(zhuǎn)錄也發(fā)揮重要作用[7]。目前，雄性生殖細(xì)胞中TB-RBP對(duì)miRNA也起到穩(wěn)定作用，而其作用機(jī)制尚不清楚[8]。犏牛作為牦牛和普通牛的雜交后代，其在役用性、抗病力及適應(yīng)性等方面均優(yōu)于親本個(gè)體，產(chǎn)肉量和產(chǎn)奶量較親本牦牛高，表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，但犏牛雄性不育和雜種優(yōu)勢(shì)是目前限制和影響牦牛遠(yuǎn)緣雜交改良工作深入開(kāi)展的關(guān)鍵問(wèn)題，因此如何利用現(xiàn)代分子技術(shù)破解動(dòng)物種間雜種雄性不育機(jī)理，也成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域最富有挑戰(zhàn)意義的重大課題之一。本研究通過(guò)對(duì)與牦牛和犏牛精子發(fā)生相關(guān)基因的研究，初步驗(yàn)證候選基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)情況。

3.1 TB-RBP基因生物學(xué)功能分析

通過(guò)對(duì)牦牛、犏牛TB-RBP基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，絲氨酸、亮氨酸、谷氨酸占比最大，且在15個(gè)磷酸化位點(diǎn)中包含10個(gè)絲氨酸位點(diǎn)。谷氨酸可參與動(dòng)、植物及微生物代謝過(guò)程中多種重要化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)也是一種重要的鮮味劑，相關(guān)研究顯示，犏牛在生長(zhǎng)性狀及屠宰性狀均優(yōu)于牦牛，且具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)，氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)含量豐富，雜種優(yōu)勢(shì)明顯[9-10]，這與其富含谷氨酸存在一定關(guān)聯(lián)。段鵬杰[11]研究發(fā)現(xiàn)，閹牛肉中谷氨酸和必需氨基酸含量均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明在日糧中添加谷氨酸渣可以促進(jìn)肉牛生長(zhǎng)。而精氨酸也可在一定程度上改善家畜胴體組成及肉質(zhì)性狀指標(biāo)，牦牛睪丸組織中絲氨酸和精氨酸含量較高，其中絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2能夠磷酸化富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子，可能參與小鼠精子發(fā)育成形過(guò)程中mRNA前體分子的剪接，是維持睪丸正常發(fā)育成形所必須[12-13]。絲氨酸作為肌肉和脂肪的重要組成成分，在其代謝及生長(zhǎng)等過(guò)程均發(fā)揮重要作用[14-15]，且絲氨酸有助于機(jī)體中抗體和免疫血球素的產(chǎn)生，使免疫系統(tǒng)免受侵害維持其健康的免疫環(huán)境，本研究中牦牛和犏牛絲氨酸含量均較多，也從側(cè)面驗(yàn)證了牦牛及犏牛對(duì)高原惡劣生態(tài)環(huán)境的極強(qiáng)適應(yīng)性。TB-RBP屬不穩(wěn)定蛋白，作為轉(zhuǎn)位蛋白參與染色體易位等生物過(guò)程，容易與特異性mRNA結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化介導(dǎo)不同的代謝過(guò)程。本試驗(yàn)中，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)存在多個(gè)α螺旋富集區(qū)，三級(jí)結(jié)構(gòu)為平行的α-螺旋/7螺旋束，說(shuō)明α螺旋富集結(jié)構(gòu)對(duì)該蛋白發(fā)揮功能所必需。

3.2 犏牛、牦牛TB-RBP基因的表達(dá)水平

TB-RBP基因的表達(dá)量牦牛顯著高于犏牛(0.01

3.3 犏牛雄性不育機(jī)理

生殖隔離表現(xiàn)為兩方面：A種和B種的雜交繁殖變成困難或者不可能，而A種個(gè)體和B種個(gè)體在其種內(nèi)，則各自都能充分地進(jìn)行繁殖。在任何物種改變行為或生育器官結(jié)構(gòu)的突變都是可能發(fā)生的，但這種突變并不能產(chǎn)生有用的RI機(jī)制。造成RI的遺傳改變，不僅一定要避免突變類(lèi)型和原始類(lèi)型之間的繁殖，還要保證突變類(lèi)型的正常繁殖。要是隔離包含著雜種不活性或雜種不育性，則這些效果必須限制在雜合體方面，而純合體不受影響。符合上述要求的突變，包括多基因突變系，染色體倍數(shù)變異、倒位、易位和細(xì)胞質(zhì)與核基因系的關(guān)系等。在有性和雜交受精的物種中要由單個(gè)突變步驟建立起熱核繁殖隔離機(jī)制是有很大困難的。因?yàn)橥蛔凅w第一次在群體中以雜合體而出現(xiàn)，不能生活和不育的雜合體總被消除掉，不論其相應(yīng)的純合體可能有多好的適應(yīng)性。產(chǎn)生隔離的突變型在起初的不利性，可因自體受精、單性生殖或無(wú)性生殖而得以減少。在成對(duì)的有性生殖和雜交受精的物種之間，RI一般是由有關(guān)物種所攜帶的互補(bǔ)基因復(fù)合體所造成的，要形成一個(gè)能夠起作用的隔離機(jī)制最少的基因數(shù)是2個(gè)，雜種不活和不育性是由互補(bǔ)基因或由呈顯性作用的遺傳條件所造成的，因而在雜合體就表現(xiàn)出來(lái)。Dobzhansky[18]認(rèn)為物種的基因型是一個(gè)適應(yīng)于該物種所生活的那個(gè)生態(tài)小境的完整系統(tǒng)，在種間雜種的后裔中，基因的重組合可能導(dǎo)致了不協(xié)調(diào)基因類(lèi)型的形成，這就降低了2個(gè)雜交繁殖生物種的繁殖力。

犏牛雄性不育是種間生殖隔離的一種表現(xiàn)，是由長(zhǎng)期自然選擇和基因突變不斷積累的結(jié)果，生物體任何性狀的改變均不是由單一基因位點(diǎn)突變決定的，而犏牛的生殖隔離也必定是多基因的產(chǎn)物。TB-RBP基因研究結(jié)果一定程度上支持鐘金城提出的犏牛雄性不育多基因假說(shuō)[19]。同時(shí)，對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因的克隆，有助于揭示精子發(fā)生過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，有助于對(duì)牦牛、普通牛及其雜種犏牛在睪丸和大腦組織中的基因組、特異基因的遺傳變異規(guī)律的研究，進(jìn)而從基因表達(dá)水平上闡明犏牛雄性不育的機(jī)理。