呂丁陽，殷麗君，陳復(fù)生*

1. 河南工業(yè)大學糧油食品學院（鄭州 450001）；2. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院（北京 100083）

早在20世紀80年代，研究人員發(fā)現(xiàn)將蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合可以大大提高蛋白質(zhì)溶解性、熱穩(wěn)定性和乳化性[1]。復(fù)合蛋白質(zhì)-多糖產(chǎn)物可用于醫(yī)療和化妝用品的功能生物活性物質(zhì)包封和遞送、食品工業(yè)中脂肪、奶油及石油替代品等[2]。蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物主要分為天然復(fù)合產(chǎn)物、靜電復(fù)合產(chǎn)物、共價交聯(lián)產(chǎn)物[3]。阿拉伯樹膠是一種具有優(yōu)良乳化特性的典型蛋白質(zhì)-多糖天然復(fù)合物，但其供應(yīng)有限、價格昂貴，限制其工業(yè)應(yīng)用[4]。Bai等[5]證實由玉米纖維、小麥麩皮、甜菜甜渣中提取的玉米纖維膠、小麥麩皮阿拉伯木聚糖、甜菜果膠具有替代阿拉伯膠的能力。乳狀液體系中的阿拉伯木聚糖-蛋白質(zhì)之間靜電相互作用需要嚴格的條件控制，如pH范圍、離子強度及溫度，且靜電相互作用過強會導(dǎo)致沉淀或不可溶，相互作用過弱會引起乳狀液絮凝進而導(dǎo)致乳狀液失穩(wěn)[6]。共價交聯(lián)主要分為美拉德反應(yīng)和酶促交聯(lián)反應(yīng)，美拉德反應(yīng)需要在嚴格條件控制下進行，在產(chǎn)生目標碳水化合物-蛋白質(zhì)綴合物過程中防止晚期黑素形成[7]。酶促交聯(lián)反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間較短，且產(chǎn)物無較重顏色，可應(yīng)用于飲料乳狀液體系，因此，近年來成為研究熱點。阿拉伯木聚糖與蛋白質(zhì)的酶促交聯(lián)反應(yīng)通常通過過氧化物酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、漆酶等實現(xiàn)[8]。因此，對催化酶交聯(lián)阿拉伯木聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物研究進展進行綜述。

1 酶及其反應(yīng)體系

1.1 過氧化物酶及其反應(yīng)體系

過氧化物酶是一種血紅素酶，其酶活性來源于結(jié)構(gòu)中血紅素基團的鐵原子循環(huán)還原和氧化[9]。由于辣根過氧化物酶作用底物廣泛，且較高溫度下穩(wěn)定性較好，常用作過氧化物酶類研究對象，其最佳作用底物常常含有酚羥基，且酚羥基鄰位被羥基或甲氧基等給電子基團取代，另一鄰位位置無取代基[10]。辣根過氧化物酶含有血紅素和2個鈣原子，血紅素位于遠端和近端區(qū)域之間，每個區(qū)域含有1個鈣原子，鈣原子通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)與血紅素結(jié)合區(qū)連接。每個鈣位點與由氨基酸側(cè)鏈羧酸（Asp）、羥基（Ser、Thr）、骨架羰基和結(jié)構(gòu)水分子（僅限遠端位點）組合提供的供氧配體七配位[11]。當多糖中的阿魏酸與辣根過氧化物酶結(jié)合時，阿魏酸的芳香環(huán)處于接近血紅素“裸露”邊緣的一個末梢位點，其中側(cè)鏈的苯甲酸基團朝向結(jié)合點，作用力包括疏水作用力和3個氫鍵[12]。蛋白質(zhì)與辣根過氧化物酶結(jié)合時，過氧化物酶（HRP）作用于酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）。最佳作用底物氨基酸為酪氨酸，在最初的單電子氧化步驟之后，可以形成鄰位二酪氨酸或異十三烷酸[13]。當過氧化物酶與α-乳白蛋白作用時，需要將α-乳白蛋白進行去除鈣離子處理。Boeriu等[14]利用過氧化物酶處理水溶性小麥阿拉伯木聚糖和β-酪蛋白時，利用動力學控制反應(yīng)，讓過氧化物酶優(yōu)先與β-酪蛋白混合，產(chǎn)生過量自由基，將阿拉伯木聚糖添加到混合物中，制得蛋白與多糖最優(yōu)摩爾比10︰1的異源結(jié)合物，并通過尺寸排阻和陰離子交換色譜將蛋白質(zhì)-阿拉伯木聚糖結(jié)合物與阿拉伯木聚糖均聚物分離，研究首次利用酶促方法大規(guī)模制備小麥阿拉伯木聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物。Boeriu[15]利用小麥阿拉伯木聚糖與α-乳白蛋白在過氧化物酶體系下進行酶促交聯(lián)，通過表征蛋白質(zhì)-阿拉伯木聚糖復(fù)合物，得出過氧化物酶可以催化阿拉伯木聚糖中的阿魏酰殘基與α-乳白蛋白的酪氨酸殘基交聯(lián)，交聯(lián)后的產(chǎn)物可作食品增稠劑。

圖1 辣根過氧化物酶X射線晶體結(jié)構(gòu)[16]

1.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及其反應(yīng)體系

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最初大多從動物組織和體液中提取，具有有害的紅色素。為了擴展其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，研究人員從微生物菌落中大規(guī)模提取轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，并將其應(yīng)用在食品工業(yè)中[17]。微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是由331個氨基組成的分子量約38 000 Da的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。其結(jié)構(gòu)為單核苷酸肽鏈，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占21%，β-片層占31%，三級結(jié)構(gòu)為球形，整個分子為親水性，并點綴著一些疏水基團，酶分子中無Ca2+結(jié)合位點，故其催化作用與Ca2+無關(guān)[18]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能催化多肽或蛋白質(zhì)谷氨酰胺酰殘基（?；w）的γ-羧基酰胺基團與賴氨酸氨基（?；荏w）的ε-氨基之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[19]。而且微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶熱穩(wěn)定性好，pH范圍廣（pH 4～9）。微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可催化交聯(lián)多種蛋白質(zhì)，其最佳作用底物為酪蛋白。由一些副產(chǎn)物如小麥麩皮、甜菜果膠中提取的阿拉伯木聚糖含有蛋白質(zhì)組分，可以通過微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與外源蛋白質(zhì)共價交聯(lián)，Liu等[20]利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)酪蛋白酸鈉和阿拉伯樹膠，并通過多角度激光光散射與高效尺寸排阻色譜結(jié)合監(jiān)測綴合程度，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以通過其共價交聯(lián)谷氨酰胺（Gln）和賴氨酸（Lys）殘基進而改善各種蛋白質(zhì)的功能特性，如酪蛋白酸鈉、乳清蛋白和大豆分離蛋白。周小華等[21]以純化微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化殼聚糖和明膠合成殼聚糖-明膠共聚物。經(jīng)紅外光譜測試表明，共聚物在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化下形成席夫共價鍵。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶體系與漆酶體系和過氧化物酶體系不同，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶只能實現(xiàn)蛋白質(zhì)與多糖之間、蛋白質(zhì)成分之間的交聯(lián)，且蛋白質(zhì)成分之間的交聯(lián)不會消耗多糖的酚酸成分。唐傳核等[22]研究并探討微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化2種異源蛋白質(zhì)的聚合情形，表明表面疏水性相仿的蛋白質(zhì)之間會發(fā)生聚合，影響蛋白質(zhì)聚合的因素主要有蛋白空間結(jié)構(gòu)位阻、蛋白質(zhì)的表面疏水性質(zhì)或空間結(jié)構(gòu)。

圖2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3D圖像[23]

1.3 漆酶及其反應(yīng)體系

漆酶是一種多酚氧化酶，存在于植物、真菌、細菌中，能氧化酚類和芳香族化合物，但不能氧化酪氨酸[24]。漆酶是單電子氧化還原酶，分子結(jié)構(gòu)中含有4個Cu原子，分別是T1（1個Cu）、T2（1個Cu）、T3（2個Cu），漆酶可通過4個Cu原子協(xié)同傳遞電子和價態(tài)變化，催化底物氧化和還原，還原性底物在T1位點結(jié)合，T1Cu提取1個電子，該電子通過Cys-His途徑傳遞到T2/T2三核中心，該位點結(jié)合第二底物分子氧并接受T1的電子傳遞給氧，使之還原為水[25]。在催化氧化酚類和芳香胺類化合物時，漆酶可以從被氧化的底物分子中提取1個電子，使之形成不穩(wěn)定自由基，該自由基可進一步發(fā)生聚合反應(yīng)或解聚反應(yīng)，分子氧被還原為水。漆酶結(jié)合位點和序列變異性相對較大，導(dǎo)致真菌漆酶極度廣泛的底物專一性[26]。漆酶作用底物雖然較廣泛，但是β-乳球蛋白（BLG）被報道為漆酶作用的不良底物，因為其酪氨酸殘基被掩埋在BLG的三維結(jié)構(gòu)中，研究表明加熱的BLG可以增強與SBP和BLG的異源結(jié)合。Jung等[27]利用漆酶交聯(lián)熱處理的β-乳球蛋白（H-BLG）與甜菜果膠（SBP），并通過使用尺寸排阻色譜、多角度激光散射、折射率和UV檢測的峰位置確認SBP和H-BLG綴合。Figueroa-Espinoza等[28]利用漆酶交聯(lián)小麥水溶性阿拉伯木聚糖與蛋白質(zhì)，改善小麥水溶性阿拉伯木聚糖的凝膠特性。

圖3 漆酶三維結(jié)構(gòu)[29]

過氧化物酶與漆酶主要作用于多糖中的阿魏酸與蛋白質(zhì)中的酪氨酸，使二者交聯(lián)進而使多糖與蛋白質(zhì)形成復(fù)合產(chǎn)物。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶主要使多糖提取過程中沉淀的蛋白質(zhì)與外源蛋白形成交聯(lián)。過氧化物酶與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通常作用時間較短，漆酶作用時間較長。在過氧化氫、多糖存在條件下，過氧化物酶催化的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)反應(yīng)的機理為：酚酸或者其他多元酚的二元酚在氧化物酶的作用氧化成鄰醌，醌在副反應(yīng)中形成二聚體，或與多肽的氨基或巰基側(cè)鏈反應(yīng)與酚環(huán)形成共價C—N或C—S鍵，并再次形成酚羥基結(jié)構(gòu)，后者可以再次被氧化并結(jié)合從而形成交聯(lián)化合物。所以在過氧化物酶體系或者漆酶體系中，多糖和蛋白質(zhì)可以形成分子內(nèi)結(jié)合物[30]。酶促交聯(lián)阿拉伯木聚糖和蛋白質(zhì)雖然具有特異性及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，但是在反應(yīng)過程中也會形成多種復(fù)雜產(chǎn)物，如阿拉伯木聚糖同源交聯(lián)、蛋白質(zhì)同源交聯(lián)。反應(yīng)產(chǎn)物由目標基團與過氧化物酶的反應(yīng)差異性及反應(yīng)基團數(shù)量和目標基團可接近性決定。阿拉伯木聚糖中碳水化合物與蛋白質(zhì)中氨基酸交聯(lián)需要暴露彼此的靶基團且不具有或具有有限的空間位阻。

2 酶促產(chǎn)物表征技術(shù)

2.1 紫外可見光吸收光譜

紫外可見光吸收光譜是由于價電子的躍遷而產(chǎn)生的分子光譜，它利用物質(zhì)的分子或離子對紫外和可見光的吸收所產(chǎn)生的紫外可見光譜及吸收程度對物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)進行分析、測定、推斷[31]。對于過氧化物酶及漆酶反應(yīng)體系，酶促反應(yīng)主要發(fā)生在多糖中的阿魏酸與蛋白質(zhì)中的酪氨酸中。通過對于反應(yīng)物阿魏酸及酪氨酸的減少及生成物的增加可以間接判定酶促反應(yīng)的發(fā)生。阿魏酸在290～310 nm處有良好的紫外吸收[32]，酈金龍等[33]通過對甜菜果膠200～800 nm全波長掃描，檢測出果膠在325 nm處有最大紫外吸收峰，而酪氨酸通常在280 nm處有良好的紫外吸收。可通過325 nm處及280 nm處吸光度的減少以證實多糖中的阿魏酸與蛋白質(zhì)中的酪氨酸參與酶促交聯(lián)反應(yīng)。李君文等[34]在阿魏酸存在條件下利用過氧化物酶交聯(lián)酪蛋白，利用A315nm/280nm的比值反映交聯(lián)反應(yīng)過程中酪蛋白、阿魏酸之間的相對變化關(guān)系。隨著反應(yīng)時間延長，A315nm/280nm比值減小，說明阿魏酸參與交聯(lián)。

2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，常用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)[35]。它有2種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小、蛋白質(zhì)形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開[36]。SDS-PAGE根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同分離蛋白質(zhì)，SDS-PAGE僅與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量有關(guān)，而與其所帶電荷和分子形狀無關(guān)。SDSPAGE凝膠電泳通常被用在美拉德反應(yīng)中糖蛋白產(chǎn)物鑒定，多糖及蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)時，反應(yīng)產(chǎn)物能夠在濃縮膠及分離膠的交界處出現(xiàn)染色條帶，或者由于大的結(jié)合物分子量在分離膠中出現(xiàn)拖尾條帶[37]。通常研究人員使用PAS（糖蛋白染色）對多糖中的糖物質(zhì)進行檢測。Schmidt等[38]利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測熱處理的乳清分離蛋白-果膠混合物，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱處理的乳清分離蛋白特征條件變淺，且凝膠注射點觀察到強烈固定的條帶，表明大分子量的富含蛋白質(zhì)的物質(zhì)被排除在侵入凝膠孔之外，而酶處理的多糖及蛋白對照組未出現(xiàn)，表明在乳清分離蛋白及果膠之間形成異源結(jié)合物。張伊寧[39]對于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾大豆分離蛋白產(chǎn)物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，與大豆分離蛋白相比，交聯(lián)產(chǎn)物泳道的7 S和11 S等亞基部分條帶明顯減少甚至消失，且分離膠及濃縮膠上緣均有大分子條帶出現(xiàn)。

2.3 傅里葉變換紅外光譜

紅外光譜分析（FTIR）是一種根據(jù)物質(zhì)的光譜來鑒別物質(zhì)及確定其化學組成、結(jié)構(gòu)或者相對含量的方法。按照分析原理，光譜技術(shù)主要分為吸收光譜、發(fā)射光譜和散射光譜3種；按照被測位置的形態(tài)分類，光譜技術(shù)主要有原子光譜和分子光譜2種[40]。紅外光譜屬于分子光譜，有紅外發(fā)射和紅外吸收光譜2種，常用的為紅外吸收光譜。紅外吸收光譜是由分子振動和轉(zhuǎn)動躍遷所引起的，組成化學鍵或官能團的原子處于不斷振動（或轉(zhuǎn)動）狀態(tài)，其振動頻率與紅外光的振動頻率相當。所以，用紅外光照射分子時，分子中的化學鍵或官能團可發(fā)生振動吸收，不同化學鍵或官能團吸收頻率不同，在紅外光譜上將處于不同位置，從而可獲得分子中含有何種化學鍵或官能團的信息[41]。Liu等[42]利用傅里葉紅外掃描從分子水平上證明了玉米麩皮阿拉伯木聚糖與牛血清白蛋白之間的交聯(lián)，牛血清白蛋白在1 650，1 545和1 387 cm-1處分別具有C＝O伸縮（酰胺Ⅰ帶），C＝N伸縮（酰胺Ⅱ帶）的N—H彎曲和C—N彎曲（酰胺Ⅲ帶）。牛血清白蛋白與玉米麩皮阿拉伯木聚糖單純混合時，混合物的紅外光譜分析顯示在1 545 cm-1處出現(xiàn)1個新譜帶，表明兩者之間可能存在氫鍵或靜電相互作用。當牛血清白蛋白與玉米麩皮阿拉伯木聚糖在過氧化物酶的存在下混合時，混合物中的譜帶移動到1 644 cm-1，并出現(xiàn)4個新峰，從而印證多糖與蛋白酶促交聯(lián)。研究人員用高效液相色譜分析方法、微觀結(jié)構(gòu)等表征方法印證多糖與蛋白質(zhì)酶促交聯(lián)[43-44]。

3 多糖-蛋白質(zhì)酶促復(fù)合物功能特性

通過酶促交聯(lián)的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物通常具有多種功能性質(zhì)，如乳化性、凝膠性、起泡性等，其中共價復(fù)合物的乳化性和凝膠性研究較多。翁靜宜等[45]研究在大分子擁擠體系下轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對7S-葡聚糖糖基化產(chǎn)物的凝膠性能影響，表明經(jīng)過酶處理后的復(fù)合物凝膠具有更加均勻及致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。有研究制備多糖蛋白相分離凝膠，其利用蛋白質(zhì)與多糖的熱力學不相容性，使半固體食品具有靈活的結(jié)構(gòu)，酶促蛋白質(zhì)-多糖凝膠具有良好的機械性能和咀嚼口感，具有很廣闊的開發(fā)前景[46]。

蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物在乳狀液體系中時，共聚物會遷移到油水界面，在油水界面上形成界面膜，減少乳狀液絮凝。乳狀液中pH和離子強度決定了蛋白質(zhì)/多糖相互作用的親和力。Guerrero等[47]證明，在恒定的蛋白質(zhì)濃度下，逐漸加入帶相反電荷的多糖可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液依次經(jīng)歷4種不同的狀態(tài)：穩(wěn)定（幾乎不含多糖）、不穩(wěn)定（橋接絮凝）、穩(wěn)定（多層形成）和不穩(wěn)定（枯竭絮凝）。Sovilj等[48]闡明蛋白質(zhì)與多糖賦予食品乳液的空間和靜電穩(wěn)定性機理，并解釋水膠體空間穩(wěn)定方面的作用。此外，乳化過程中添加單個蛋白質(zhì)，多糖或其混合物的順序至關(guān)重要，因為它控制界面處蛋白質(zhì)/多糖的組織和結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生所謂的雙層乳液或混合乳液[49]。張伊寧[39]利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)明膠和酪蛋白，交聯(lián)后的產(chǎn)物具有優(yōu)良的乳化特性和消化特性。李君文等[34]在阿魏酸存在條件下利用過氧化物酶交聯(lián)酪蛋白，表明交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性分別提高25.2%和7.0%。

4 結(jié)語與展望

通過酶促反應(yīng)對蛋白質(zhì)和多糖進行結(jié)合，可以改善兩者的功能特性。蛋白質(zhì)-多糖共價復(fù)合物對于控制生物活性物質(zhì)在食品基質(zhì)中的釋放有很大潛力。對于酶促多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究，仍需要不斷的完善和充實。應(yīng)更加深入了解多糖與蛋白質(zhì)的交聯(lián)機制及其在乳狀液、凝膠體系中的應(yīng)用，使酶促共價復(fù)合物的工業(yè)化成為可能。