唐賢華

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 酒類與食品工程系，四川 都江堰 611830）

白酒發(fā)酵是由多種微生物共同參與，在開放性的環(huán)境中進(jìn)行的一個(gè)復(fù)雜過程[1]。窖泥的質(zhì)量可直接決定酒質(zhì)的優(yōu)劣，歸根到底對白酒發(fā)酵過程起決定性作用的是窖泥微生物[2]。微生物以空間位置相對固定的窖泥作為棲息地[3]，且經(jīng)過釀酒環(huán)境長時(shí)間的馴化，已經(jīng)形成了一個(gè)較為穩(wěn)定的微生物群落，并形成了一批具有產(chǎn)酒、產(chǎn)香功能的微生物，合理開發(fā)利用這些微生物，對白酒品質(zhì)的提升有重大意義[4]。

目前關(guān)于窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)的研究方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克隆文庫技術(shù)、PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）分析、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜技術(shù)和高通量測序（high throughput sequencing，HTS）技術(shù)。其中高通量測序技術(shù)，又稱“下一代”測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，能夠深度測序，是新一代測序技術(shù)。與其他方法相比，具有規(guī)模更大，通量更高，耗時(shí)越短等優(yōu)勢，可以快捷方便的讀取樣品中復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)，是分析復(fù)雜多菌種樣品的首選方法，已被廣泛應(yīng)用于動植物科學(xué)、醫(yī)學(xué)、土壤學(xué)等領(lǐng)域[5]。目前，關(guān)于采用高通量測序技術(shù)研究窖泥微生物群落的研究已有報(bào)道，王莉等[6]采用高通量測序技術(shù)對醬香型窖池窖底微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著窖底泥的不斷馴化，乳桿菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群；雷振河[7]采用高通量測序技術(shù)對清香型大曲和酒醅中的微生物進(jìn)行了測定，對比二者在微生物群落結(jié)構(gòu)上的差異，得出大曲中優(yōu)勢原核微生物和真核微生物的種類；鄧杰等[8-9]利用高通量測序技術(shù)研究不同窖齡的瀘州老窖窖泥中細(xì)菌及古菌群落的分布情況；劉延波等[10]利用高通量測序技術(shù)分析濃香型白酒中溫曲和高溫曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并從中溫曲中首次檢測到小球菌屬（Pediococcus）、泛菌屬（Pantoea）、邁勒吉爾霉菌屬（Melghirimyces）等微生物，豐富了大曲中的微生物種類；呂錫斌等[11]運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析了醬香型白酒下糙沙輪次微生物多樣性，確定了下糙沙的主要微生物種類，反映了不同階段微生物群落特點(diǎn)。

本研究采用高通量測序技術(shù)對濃香型白酒窖泥的微生物群落進(jìn)行全面的研究，分析濃香型白酒窖泥細(xì)菌的主要構(gòu)成，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）對窖泥細(xì)菌的影響進(jìn)行評價(jià)，有助于更好的了解濃香型窖泥微生物工作機(jī)理，為建立濃香型白酒窖泥微生物信息數(shù)據(jù)庫、提升濃香型白酒質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥樣品：取自川南某白酒廠3個(gè)同期建造車間中的9口窖池，且窖池連續(xù)生產(chǎn)10年以上，取樣部位為每口窖底中心部位，取得窖泥樣品后將其編號為1～9，其中1～3、4～6、8～9為分別同一車間不同窖池窖泥。所取樣品用塑封袋密封后，迅速置于低溫取樣盒中冷藏運(yùn)回，并在-20 ℃條件下低溫冷凍保存。

1.1.2 試劑

PowerSoil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit：美國MOBIO公司；Gel Extraction Kit：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Quant-iT PicoGreen DNA Kit：美國nvitrogen公司；無水乙醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；Buffer、MgCl2、ExTaq酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、DNA Marker：日本Takara公司；引物：上海生工生物有限公司；高通量測序試劑：美國Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S28恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SORVALLStratos高速冷凍離心機(jī)、Thermo 900超低溫冰箱：美國Thermo Scientific公司；TGL-16G臺式高速離心機(jī)：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；Minisubcell水平電泳儀、GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)、MyCycler PCR儀：美國Bio-Rad公司；D-160均質(zhì)機(jī)：美國Scilogex公司；GS junior高通量測序儀：美國Roche公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥總DNA提取

采用PowerSoil DNA Isolation Kit提取窖泥微生物總DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，DNA樣品于-20 ℃保存[12]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以提取的窖泥微生物總DNA為模板，采用正向引物968FMID1～9和反向引物1401RMID1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2 μL，MgCl22μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，5U/μLExTaq酶0.5μL，DNA模板0.3 μL，雙蒸水（ddH2O）16.7 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，檢測合格后送去測序，測序時(shí)通過正向引物上的數(shù)字標(biāo)簽區(qū)分不同樣品。

1.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化

采用Gel Extraction Kit對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化以除去引物二聚體，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。采用Quant-iT PicoGreen Kit對純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量[13]。

1.3.4 高通量測序

以定量好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行微乳滴PCR（emulsion PCR，emPCR），emPCR擴(kuò)增體系：Mol.Bio.Grade Water 410μL，Additive515μL，AmpMix270μL，AmpPrimer80μL，Enzyme Mix 70 μL，Ppiase 2 μL。emPCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火4.5 min，68 ℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)，10 ℃保溫。采用高通量測序技術(shù)對emPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

通過Cope V1.2.3.3軟件進(jìn)行序列拼接及過濾后利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法在97%的相似度水平下對窖泥樣品中細(xì)菌的操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行劃分[14]。利用SPSS 20.0軟件對窖泥樣品的細(xì)菌屬進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)長度及序列有效性分析

以9個(gè)窖泥樣品的DNA為模板，采用帶有特殊標(biāo)簽的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，以其為模板進(jìn)行emPCR擴(kuò)增，emPCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度在450 bp左右。采用高通量測序技術(shù)對emPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過標(biāo)簽信息區(qū)分不同樣品。本次測序共獲得298 405條序列，序列堿基平均長度為321 bp，序列堿基長度分布見圖1。由圖1可知，大部分序列的堿基長度集中在450 bp左右，序列堿基長度與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)堿基長度基本一致。經(jīng)過Cope V1.2.3.3軟件篩選過濾掉低質(zhì)量序列和重復(fù)序列，最終獲得有效序列66 322條，有效序列的堿基長度在450 bp左右。

2.2 窖泥中細(xì)菌門的分類

圖1 測序序列堿基長度的分布Fig.1 Distribution of base length of sequencing sequences

9個(gè)窖泥樣品共獲得2 050個(gè)可操作分類單元，其中1、2、3號窖泥樣品的OTU數(shù)分別是249、297、492個(gè)；4、5、6號窖泥樣品的OTU數(shù)分別是195、61、305個(gè)；7、8、9號窖泥樣品的OTU數(shù)分別是178、63、210個(gè)。采用Mothur軟件對以上數(shù)據(jù)分析處理，獲得不同細(xì)菌門分類，結(jié)果見圖2。

圖2 不同窖泥樣品中細(xì)菌群落門的分類Fig.2 Classification of bacterial community in different pit mud samples based on phylum

由圖2可知，9個(gè)窖泥樣品中共劃分出9個(gè)門，分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chlorflexi）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、無壁菌門（Tenericutes）、螺旋體門（Spirochaetes）和球孢菌門（Lebtisphaeria）。9個(gè)門中既有厭氧菌又有好氧菌，也有兼性厭氧菌，說明白酒發(fā)酵并不是處于單一嚴(yán)格厭氧的環(huán)境中。在每個(gè)窖泥樣品的細(xì)菌群落中，F(xiàn)irmicutes占主導(dǎo)地位，其占30%～55%；該類菌具有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，并且大多數(shù)能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子抵抗極端環(huán)境。Bacteroidetes占1%～7%，其中窖泥樣品4和9的Bacteroidetes數(shù)量較為接近，Bacteroidetes的大多數(shù)細(xì)菌寄生在動物腸道內(nèi)，有部分屬于病原菌。在窖泥樣品1、2、3中未發(fā)現(xiàn)有Chlorflexi的存在，其他窖泥樣品中，Chlorflexi占2%～4%。Synergistetes有降解氨基酸能力，部分為專性厭氧，且能耐60 ℃的高溫；Synergistetes在不同窖泥樣品都有分布，占比為1%～6%。Proteobacteria是細(xì)菌中最大的一個(gè)門，大多數(shù)具有固氮能力，兼性或?qū)Ｐ詤捬酰舶ê芏嗖≡?；窖泥樣品中Proteobacteria占1%～4%。Actinobacteria大多數(shù)為好氧菌，少部分厭氧，可以產(chǎn)生抗生素；窖泥樣品7、8、9中未發(fā)現(xiàn)有Actinobacteria的存在，且在其他不同窖泥樣品中所占比例差異較大，為2%～11%。Tenericutes和Spirochaetes在不同窖泥樣品中所占比例基本相同，分別占1%～5%和1%～4%。Lebtisphaeria在不同窖泥樣品中的占比較為一致，都在1%左右。

2.3 窖泥中細(xì)菌屬的分類

在窖泥樣品中細(xì)菌門分類的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對窖泥樣品中的細(xì)菌屬進(jìn)行分類，結(jié)果見圖3。

圖3 不同窖泥樣品中細(xì)菌群落屬的分類Fig.3 Classification of bacterial community in different pit mud samples based on of genus

由圖3可知，9個(gè)窖泥樣品中共獲得39個(gè)細(xì)菌屬，各個(gè)細(xì)菌屬在不同窖泥中的分布有以下特點(diǎn)：八疊球菌屬（Sporobacter）在窖泥樣品1、2、3中占15%左右，而在其他窖泥中所占比例為6%左右；Sporobacter能在厭氧條件下代謝產(chǎn)生有機(jī)酸和芳香族化合物[15-16]。芽孢桿菌屬（Bacillus）在所有窖泥樣品中都存在，其中在5號窖泥中占比最高達(dá)到32.76%。紅蝽?xiàng)U菌屬（Coriobacterium）是一種厭氧菌[17]，在窖泥樣品1、2、3中占5%左右，在其他窖泥樣品中占2%～3%。梭菌屬（Clostridium）在窖泥樣品1、2、3中所占比例較高，約為12%；其次是窖泥樣品4和6，約占3%；窖泥樣品7、8、9中最少，只占1%；梭菌屬（Clostridium）是一類嚴(yán)格厭氧菌，能夠代謝產(chǎn)生有機(jī)酸和醇[18]。纖維素單胞菌屬（Cellu-lomonas）在窖泥樣品1、2、3中約占4%，在其他窖泥中約占2%左右；纖維素單胞菌能夠產(chǎn)生纖維素酶[19]，能夠提高釀酒原料的利用率。氨基桿菌屬（Aminobacter）在1、2、3號窖泥中占比最高，約占6%，4、6號窖泥中約占3%，7、8、9號窖泥中最少，不到1%，氨基桿菌屬能夠在厭氧條件下降解氨基酸[20]。棒桿菌屬（Corynebacterium）在1、2、3號窖泥中約占3%，在其他窖泥中占不到1%。芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）在1、2、3號窖泥中所占比最少，占2%左右，4、6號窖泥中占6%左右，8、9號窖泥中所占比最高約10%。相同車間窖泥中芽孢八疊球菌屬（Sporobacter）、Coriobacterium、Clostridium、Cellulomonas、Sediminibacter、Aminobacter、Corynebacterium、Sporosarcina所占比例基本相同。脫鹵素桿菌屬（Dehalobacter）、醋桿菌屬（Acetobacter）、互營菌屬（Syntrophus）、冷單胞菌屬（Psychromonas）只在7、8、9號窖泥中發(fā)現(xiàn)有一定比例的分布，而在其他窖泥中均未檢測出。

2.4 窖泥中細(xì)菌主成分分析

對9個(gè)窖泥樣品中的39個(gè)細(xì)菌屬進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表1。由表1可知，成分1、成分2、成分3、成分4的特征值＞5，分別為10.414、10.094、7.634、5.446，累積貢獻(xiàn)達(dá)到83.97%。張文彤[21]在《IBM SPSS數(shù)據(jù)分析與挖掘?qū)崙?zhàn)案例精粹》中說方差貢獻(xiàn)率達(dá)到50%就可以酌情接受。為了統(tǒng)計(jì)方便，本研究選取方差貢獻(xiàn)率最大的前兩個(gè)主成分（累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到51.27%）進(jìn)行討論分析。因此按照成分1和成分2對窖泥中的細(xì)菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。細(xì)菌屬的主成分載荷值矩陣見表2。

表1 細(xì)菌屬的主成分特征值Table 1 Principal components eigenvalues of bacteria

圖4 按主成分1和主成分2劃分的窖泥樣品分布圖Fig.4 Distribution map of pit mud samples according to PC1 and PC2

由圖4可知，窖泥樣品1、2、3，4、6，7、9分別聚為一組，基本按不同車間窖泥進(jìn)行劃分，窖泥樣品5、8聚為一組，分析原因可能是測序序列都較少，微生物覆蓋率較低的緣故。

表2 細(xì)菌屬的主成分載荷值矩陣Table 2 Principal components load matrix of bacteria

由表2可知，主成分1中，載荷值較高的細(xì)菌屬為Sporobacter、Coriobacterium、Clostridium、Cellulomonas、Sediminibacter、Aminobacter、Corynebacterium、Sporosarcina，載荷值分別為0.974、0.924、0.919、0.913、0.856、0.855、0.814、-0.808。其中，Sporosarcina對主成分1產(chǎn)生負(fù)向影響，其余為正向影響。主成分2中，載荷值較高的細(xì)菌屬為厭氧原體屬（Anaeroplasma）、Dehalobacter、Acetobacter、Syntrophus、Psychromonas，載 荷值分別為0.970、0.970、0.970、0.970、0.881，都為正向影響。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要通過高通量測序法分析了濃香型白酒不同窖泥樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。通過高通量測序共獲得66 322條有效序列，2 050個(gè)OTU。其中窖泥樣品1、2、3平均獲得351個(gè)OTU，窖泥樣品4、5、6平均獲得214個(gè)OTU，窖泥樣品7、8、9平均獲得153個(gè)OTU。根據(jù)OTU，9個(gè)不同窖泥樣品中共分為9個(gè)門類，其中窖泥樣品1、2、3中共有6個(gè)門類，窖泥樣品4、5、6中共有9個(gè)門類，窖泥樣品7、8、9中共有8個(gè)門類。9個(gè)門類分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chlorflexi）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、柔壁菌門（Tenericutes）、螺旋體門（Spirochaetes）和Lebtisphaeria，其中Firmicutes占主導(dǎo)地位。在細(xì)菌門分離的基礎(chǔ)上，9個(gè)窖泥樣品中共獲得39個(gè)細(xì)菌屬。通過主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)，其中13個(gè)細(xì)菌屬對窖泥來源劃分的貢獻(xiàn)度較高。相同車間窖泥中Sporobacter、Coriobacterium、Clostridium、Cellulomonas、Sediminibacter、Aminobacterium、Corynebacterium、Sporosarcina所占基本相同。Dehalobacter、Acetobacter、Syntrophus、Psychromonas只在7、8、9號窖泥中發(fā)現(xiàn)有一定比例的分布，而在其他窖泥中均未檢測出，說明相同生產(chǎn)環(huán)境的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)基本是一致的。