夏瑤瑤，閆裕峰，梁 楷，郎繁繁，武耀文，田 莉

（1.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030040；2.山西省食品工業(yè)研究所，山西 太原 030024）

釀醋先釀酒，酒精發(fā)酵是釀造老陳醋的關(guān)鍵工序，在整個(gè)釀造過(guò)程中起著承上啟下的作用，酒醪的品質(zhì)是影響老陳醋產(chǎn)量及質(zhì)量最為重要的因素[1-2]。就酒精發(fā)酵而言，老陳醋釀造過(guò)程中一般采用可溶性固形物含量為20%～24%發(fā)酵醪，成熟發(fā)酵醪的酒精含量為7%vol～9%vol；濃醪發(fā)酵指發(fā)酵底物糖化醪中含有30%或更高的可溶性固形物含量，成熟發(fā)酵醪的酒精度均在13%vol以上，濃醪發(fā)酵可顯著提升酒精的品質(zhì)與產(chǎn)量，降低資源、能源的消耗，節(jié)約成本[3-4]。

濃醪酒精發(fā)酵起始于20世紀(jì)70年代，經(jīng)過(guò)幾十年的研究發(fā)展，已取得了一定的研究成果。張強(qiáng)等[5]用玉米粉進(jìn)行濃醪酒精發(fā)酵，得出糖化酶、蛋白酶、料水比、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)甘氨酸、脯氨酸以及肌醇均會(huì)影響酒精濃度；張欣等[6]在濃醪酒精發(fā)酵中添加木聚糖酶，有效降低了醪液黏度，提高了出酒率，縮短了發(fā)酵時(shí)間；宋璐[7]篩選出四種菌株用于濃醪酒精發(fā)酵，同時(shí)制得了活性干酵母。對(duì)濃醪酒精發(fā)酵的研究大多集中在酶、酵母菌以及添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方面，而在濃醪酒精發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分割式發(fā)酵，還鮮見(jiàn)相關(guān)研究。

在濃醪酒精發(fā)酵過(guò)程中，高底物濃度和高酒精濃度會(huì)對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，若為酵母菌提供充足的氮源營(yíng)養(yǎng)，可提高酵母菌對(duì)酒精的耐受性，同時(shí)進(jìn)行分割式發(fā)酵可有效克服底物濃度及酒精濃度的抑制效果[8-9]。本研究以榨油后的副產(chǎn)物大豆粕和花生粕為原料[10-11]，接種產(chǎn)蛋白酶菌種米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951，制作一種生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑應(yīng)用于發(fā)酵，為酵母菌提供豐富的氮源；同時(shí)采用不斷取醪、補(bǔ)料的方法進(jìn)行分割式發(fā)酵，再利用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵過(guò)程的糧水比、生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量及大曲用量進(jìn)行優(yōu)化。老陳醋分割式濃醪酒精發(fā)酵繼承了傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了老陳醋酒精發(fā)酵的連續(xù)性生產(chǎn)，不僅可提高酒醪的酒精度和原料的利用率，還能降低水耗、能耗，節(jié)約成本，增加企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)提升老陳醋的產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、麩皮、谷糠、稻殼、大豆粕、花生粕：市售；快曲、大曲：山西紫林醋業(yè)股份有限公司；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、葡萄糖：天津歐博凱化工有限公司；亞鐵氰化鉀：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.951：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；淀粉酶（1.5×105U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALKOMAT酒精檢測(cè)儀：德國(guó)福林斯公司；AR124CN電子天平：奧豪斯儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱、SDK-98-Ⅱ電爐：天津泰斯特儀器有限公司；HH-4型水浴鍋：常州榮華儀器制造有限公司；78-1型磁力電熱攪拌器：江蘇榮華儀器制造有限公司；雷磁PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的制備工藝流程及操作要點(diǎn)[12-14]

操作要點(diǎn)：將大豆粕與花生粕干蒸5 min，與麩皮、面粉混合，加熱水?dāng)嚢杈鶆?，?rùn)料20 min；潤(rùn)料結(jié)束后將物料蒸煮5 min，再接種米曲霉AS3.951，接種溫度為40 ℃；將接種后的物料放入發(fā)酵池中，均勻攤開(kāi)，厚度為30 cm左右，先靜置培養(yǎng)6 h，當(dāng)溫度上升至37 ℃時(shí)通風(fēng)降溫至35 ℃，培養(yǎng)5～6 h后進(jìn)行翻料，翻料4～5 h后進(jìn)行第二次翻料，再培養(yǎng)7～9 h后整個(gè)物料會(huì)著生孢子，生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑即制備完成。制備好的生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑應(yīng)結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)部的白色菌絲茂盛，著生的淡黃綠色孢子緊密，無(wú)灰黑色夾心，水分含量應(yīng)為30%～35%，蛋白酶活力＞1 000 U/g（以干基計(jì)）。

1.3.2 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備工藝優(yōu)化

稱取一定比例的大豆粕與花生粕，拌入50%的麩皮和15%的面粉，加入一定量的熱水?dāng)嚢杈鶆?，接種米曲霉，制備生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑。將高粱粉碎、潤(rùn)料及液化后，加快曲糖化30 min，制得糖化液。將5%生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑、40%大曲、0.02%酵母菌添加到糖化液中，進(jìn)行酒精發(fā)酵。以發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度為考察指標(biāo)，選擇大豆粕與花生粕質(zhì)量比（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）、加水量（60%、70%、80%、90%、100%）、米曲霉接種量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）為考察因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，確定生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備過(guò)程的最佳工藝參數(shù)。

1.3.3 分割式濃醪酒精發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)[15-17]

操作要點(diǎn)：將高粱粉碎，加水潤(rùn)料，加淀粉酶液化60～90 min，加快曲糖化30 min，得到糖化液。添加5%生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑、40%大曲、0.02%酵母，進(jìn)行分割式濃醪酒精發(fā)酵，即發(fā)酵前3 d進(jìn)行敞口發(fā)酵，第4天起密封，維持10 d的養(yǎng)醪發(fā)酵，然后分離30%的酒醪進(jìn)入醋酸發(fā)酵階段，同時(shí)補(bǔ)充30%上述的糖化液，加入5%生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑、40%大曲，進(jìn)行3 d的養(yǎng)醪發(fā)酵。每次酒精發(fā)酵結(jié)束后，重復(fù)進(jìn)行出醪與補(bǔ)料，8～10輪后結(jié)束分割式濃醪酒精發(fā)酵。

1.3.4 分割式濃醪酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度（Y）為響應(yīng)值，選擇糧水比（X1）、生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量（X2）、大曲用量（X3）為考察因素，設(shè)計(jì)3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定分割式濃醪酒精發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，其因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests

1.3.5 測(cè)定方法

酒精度測(cè)定：取100 mL發(fā)酵液加100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL溶液，用酒精檢測(cè)儀測(cè)定酒精度；淀粉的測(cè)定：采用酸水解法[18]；總酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮、不揮發(fā)酸、總酯、可溶性總固形物、食鹽的含量：按照國(guó)標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》的方法進(jìn)行測(cè)定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備工藝優(yōu)化

2.1.1 大豆粕與花生粕最佳質(zhì)量比的確定

由圖1可知，酒醪的酒精度隨大豆粕與花生粕質(zhì)量比的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)大豆粕與花生粕質(zhì)量比為5∶1時(shí)，酒精度最高，為9.32%vol。這是由于大豆粕與花生粕質(zhì)量比為5∶1時(shí)所制得的生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的質(zhì)量最優(yōu)，可為酵母菌提供最適的氮源營(yíng)養(yǎng)，利于酵母菌的生長(zhǎng)及代謝，使得酒精發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度最高。因此，大豆粕與花生粕的最佳質(zhì)量比為5∶1。

圖1 大豆粕與花生粕質(zhì)量比對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of mass ratio of soybean meal to peanut meal on alcohol content

2.1.2 最適加水量的確定

加水量的多少與所制得的生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的質(zhì)量密切相關(guān)。若加水量過(guò)少，米曲霉的生長(zhǎng)代謝及酶的分泌會(huì)受到影響；但水分過(guò)高，易產(chǎn)生雜菌，生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的質(zhì)量會(huì)下降[20]。應(yīng)保證潤(rùn)料結(jié)束后物料的含水量為50%～55%較為適宜。由圖2可知，酒醪的酒精度隨加水量的多少先增加后減小，當(dāng)加水量為80%時(shí)，酒精度最高，為9.32%vol。因此，生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備過(guò)程中的最適加水量為80%。

圖2 加水量對(duì)酒精度的影響Fig.2 Effect of water addition on alcohol content

2.1.3 米曲霉最佳接種量的確定

由圖3可知，當(dāng)米曲霉接種量＜0.04%時(shí)，酒醪的酒精度隨接種量的增加而增加；接種量為0.04%時(shí)，酒精度最高，為9.64%vol；當(dāng)接種量＞0.04%時(shí)，酒精度隨接種量的增加反而降低，這是由于接種量過(guò)大，米曲霉會(huì)消耗物料中的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖，使得生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的質(zhì)量下降，進(jìn)而影響酒醪的酒精度。因此，米曲霉的最佳接種量為0.04%。

圖3 米曲霉接種量對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effect of Aspergillus oryzae inoculum on alcohol content

2.1.4 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

以發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度為考察指標(biāo)，大豆粕與花生粕質(zhì)量比（A）、加水量（B）、米曲霉接種量（C）為考察因素，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，確定生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備過(guò)程的最佳工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for preparation process optimization of biological nitrogen source nutrients

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，3種因素對(duì)酒精度的影響順序?yàn)椋捍蠖蛊膳c花生粕質(zhì)量比＞米曲霉接種量＞加水量。生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑制備過(guò)程工藝參數(shù)的最優(yōu)組合為A2B2C2，即大豆粕與花生粕質(zhì)量比5∶1、加水量80%、米曲霉接種量0.04%。按最佳的工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，最終酒醪的酒精度為9.65%vol。由表3可知，該模型顯著，且大豆粕與花生粕質(zhì)量比對(duì)酒精度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），加水量與米曲霉接種量對(duì)酒精度的影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.2 分割式濃醪酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 最佳糧水比的確定

圖4 糧水比對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effect of grain to water ratio on alcohol content

由圖4可知，酒精發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度隨糧水比在1.0∶2.0～1.0∶4.0（kg∶L）的范圍呈先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)糧水比為1.0∶2.0～1.0∶2.5（kg∶L）時(shí)，料液太過(guò)濃稠，流動(dòng)性差且物料混合不均勻，導(dǎo)致液化與糖化不徹底，糖類物質(zhì)無(wú)法被酵母菌充分利用，使得酒醪的酒精度很低[21]；當(dāng)糧水比為1.0∶2.5（kg∶L）時(shí)，酒精度最高，為12.05%vol；當(dāng)糧水比在1.0∶2.5～1∶4.0（kg∶L）時(shí)，料液變稀，糖類物質(zhì)減少，酒精度降低。因此，最佳糧水比為1.0∶2.5（kg∶L）。

2.2.2 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑最佳用量的確定

圖5 生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量對(duì)酒精度的影響Fig.5 Effect of biological nitrogen source nutrient addition on alcohol content

由圖5可知，當(dāng)生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量為2%～4%時(shí)，酒精度隨用量的增加而增加，生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量為4%時(shí)，酒精度最高，為12.79%vol，這是由于生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的使用可降低高濃度酒精對(duì)酵母菌的抑制作用，加快酵母菌的發(fā)酵速率，最終提高酒醪的酒精度[22]。但當(dāng)生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量＞4%時(shí)，繼續(xù)加大營(yíng)養(yǎng)劑的用量，酒精度反而下降，原因是若氮源濃度過(guò)高，在酒精發(fā)酵過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)氮分解代謝產(chǎn)物阻遏狀態(tài)，從而影響細(xì)胞對(duì)氮源的吸收，不利于發(fā)酵終產(chǎn)物酒精的積累[23]。因此，生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的最佳用量為4%。

2.2.3 大曲最佳用量的確定

圖6 大曲用量對(duì)酒精度的影響Fig.6 Effect of Daqu addition on alcohol content

大曲是老陳醋釀造過(guò)程中的糖化發(fā)酵劑，大曲的用量會(huì)影響酒精發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度。由圖6可知，當(dāng)大曲用量在0～20%時(shí)，酒精度隨大曲用量的增加而增加；當(dāng)大曲用量為20%時(shí)，酒醪的酒精度為12.74%vol；繼續(xù)增加大曲用量，酒精度基本不變。因此，大曲的最佳用量為20%。

2.2.4 分割式濃醪酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面法試驗(yàn)

以發(fā)酵結(jié)束后酒醪的酒精度（Y）為響應(yīng)值，糧水比（X1）、生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量（X2）、大曲用量（X3）為考察因素，進(jìn)行3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定濃醪酒精發(fā)酵最佳工藝參數(shù)。其設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken tests

續(xù)表

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4的結(jié)果進(jìn)行分析，得到酒精度的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=12.76+0.94X1+0.64X2+0.38X3+0.14X1X2+0.21X1X3-0.12X2X3-1.48X12-0.95X22-1.01X32

由表5可知，二次回歸模型的F值為287.32，P＜0.000 1，模型達(dá)到了極顯著水平。失擬項(xiàng)的P=0.103 6＞0.05，差異不顯著，故試驗(yàn)無(wú)失擬因素存在，可反映實(shí)際的情況，所選的二次回歸模型是適合的?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.997 3，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.993 8，說(shuō)明模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，模型成立，可用此模型對(duì)該試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模型的變異系數(shù)為0.98%，說(shuō)明試驗(yàn)可靠。根據(jù)回歸方程的方差分析結(jié)果可知，模型中一次項(xiàng)X1、X2、X3、交互項(xiàng)X1X3、二次項(xiàng)對(duì)酒精度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2對(duì)酒精度的影響達(dá)顯著水平（P＜0.05）；交互項(xiàng)X2X3對(duì)酒精度沒(méi)有顯著性影響（P＞0.05）。

用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)回歸方程分析，作三維空間的曲面圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，三個(gè)響應(yīng)面圖均有最高點(diǎn)，即酒精度有最大值，在固定其中兩因素的條件下，酒精度隨各因素的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)。響應(yīng)面圖的坡度陡峭表明該因素對(duì)酒精度的影響較大，坡度平緩代表該因素對(duì)酒精度的影響較小，故根據(jù)圖7可知各因素對(duì)酒精度的影響順序?yàn)椋杭Z水比＞生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量＞大曲用量，與表5的方差分析結(jié)果一致。

圖7 糧水比、生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量、大曲用量的交互作用對(duì)酒精度影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.7 Response surface and contour lines of the interaction between grain to water ratio,biological nitrogen source nutrient addition and Daqu addition on alcohol content

通過(guò)響應(yīng)面法分析試驗(yàn)得到分割式濃醪酒精發(fā)酵過(guò)程的最佳工藝參數(shù)為糧水比1.00∶2.68（kg∶L），生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量4.35%，大曲用量22.05%，在此條件下，酒醪的酒精度預(yù)測(cè)值為13.07%vol。考慮到實(shí)際操作的可行性，將上述工藝參數(shù)進(jìn)行修正，即糧水比1.0∶2.7（kg∶L），生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量4%，大曲用量20%，采用修正后的參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到酒精度的平均值為12.89%vol，與預(yù)測(cè)值13.07%vol相差不大。因此，利用響應(yīng)面法分析試驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)可進(jìn)行實(shí)際的酒精發(fā)酵工序操作。

2.3 分割式濃醪酒精發(fā)酵與稀醪酒精發(fā)酵的對(duì)比

傳統(tǒng)的稀醪酒精發(fā)酵糧水比為1.0∶4.0～4.3（kg∶L），采用1.0∶2.7（kg∶L）的分割式濃醪酒精發(fā)酵可減少潤(rùn)料水及冷卻水用量，顯著降低水耗；稀醪酒精發(fā)酵的周期為16 d，大曲用量為40%，以發(fā)酵相同量的原料高梁計(jì)，采用分割式濃醪酒精發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間可節(jié)省16%～20%，大曲用量減少18%～24%，節(jié)約了能耗與生產(chǎn)成本。兩種發(fā)酵方法所制得的酒醪及半成品老陳醋的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分別見(jiàn)表6與表7。

表6 酒醪理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of physicochemical indexes of wine mash

由表6可知，兩種酒醪的理化指標(biāo)存在一定差異，采用分割式濃醪酒精發(fā)酵得到的酒醪酒精度為12.89%vol，與稀醪酒精發(fā)酵相比，酒精度提高了4.18%vol，殘還原糖可降低至0.08 g/100 mL，殘淀粉可降低至0.28 g/100 mL。

表7 老陳醋理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination results of physicochemical indexes of aged vinegar g/100 mL

由表7可知，兩種方法所釀造的同酸度老陳醋其部分理化指標(biāo)存在一定差異，分割式濃醪酒精發(fā)酵所釀造的老陳醋氨基酸態(tài)氮含量為0.25 g/100 mL，總酯含量為3.36 g/100 mL，分別較稀醪酒精發(fā)酵分別提高了25%與17%。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)得到分割式濃醪酒精發(fā)酵所需的生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑的最優(yōu)制備工藝參數(shù)為：大豆粕與花生粕質(zhì)量比5∶1、加水量80%、米曲霉接種量0.04%；經(jīng)響應(yīng)面法分析試驗(yàn)得到分割式濃醪酒精發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為糧水比1.0∶2.7（kg∶L），生物氮源營(yíng)養(yǎng)劑用量4%，大曲用量20%，最終酒醪的酒精度為12.89%vol。與稀醪酒精發(fā)酵相比，分割式濃醪酒精發(fā)酵大曲用量節(jié)約18%～24%，發(fā)酵時(shí)間節(jié)省16%～20%；酒醪酒精度提高了4.18%vol，所釀造的老陳醋氨基酸態(tài)氮及總酯含量分別提高了25%與17%。