吳仁蔚，陳亨業(yè)，2，郭俊陸，閆裕峰，楊 勇，陳福生

（1.華中農業(yè)大學 食品科學與技術學院 湖北省傳統(tǒng)發(fā)酵食品國際科技合作基地，湖北 武漢 430070；2.中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074；3.山西老陳醋集團有限公司，山西 太原 030013；4.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400；5.四川保寧醋有限公司，四川 閬中 637400）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）是一種新型廣譜生物防腐劑，能抑制多種細菌[1-3]和真菌[4-5]的生長。20世紀90年代，WILKINS A等[6]就認為蜂蜜中的PLA是抑菌物質之一。DIEULEVEUXV等[7]報道了以白地霉（Geotrichum candidum）為熟化劑制作的干酪對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）具有抑制作用，經純化和分析確定PLA是主要的抑菌物質。研究還發(fā)現(xiàn)，PLA擁有與丹參素相似的藥理功能，具有用作抑制血小板聚集和治療急性心肌梗死藥物的潛力[8]。因此PLA在食品防腐和醫(yī)藥行業(yè)具有良好的應用前景。

PLA可通過化學合成或微生物轉化法制備。其中，微生物轉化法具有環(huán)境友好、副產物少等優(yōu)點[9]，一直是國內外研究的熱點。目前，已經發(fā)現(xiàn)白地霉[7]、多種乳酸菌[10-12]和凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[13]等均可產生PLA，但PLA產量都不高，還無法實現(xiàn)工業(yè)化生產[14]。

食醋是一種世界性的酸性調味品。按照原料的不同，食醋可分為以高粱、稻谷、小麥等谷物為主要原料釀造的谷物醋，以及以葡萄、蘋果等水果為原料釀造的果醋。我國的四大傳統(tǒng)名醋山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川保寧麩皮醋和福建永春紅曲醋，以及日本的黑醋是谷物醋的典型代表；而意大利的香醋（Balsamic vinegar）、西班牙的雪莉醋（Sherry vinegar）和美國的蘋果醋等則是水果醋的典型代表[15]。

無論是谷物醋還是果醋，特別是以傳統(tǒng)工藝釀造的，都富含功能性成分，具有多種生理功能。如食醋中的阿魏酸（ferulic acid）[16]、沒食子酸（gallic acid）均表現(xiàn)出很好的抗氧化作用；而川穹嗪（ligustrazine）則具有改善血液循環(huán)的作用[17]。這些功能成分可由食醋釀造過程中的微生物產生[18-19]，也可來自原料或由釀造工藝決定[20-21]。盡管食醋中多種功能性成分已被報道，但是仍有更多功能性成分有待發(fā)掘。

大量研究表明，采用傳統(tǒng)工藝釀造的食醋具有多種生理功能，但對應的功能性化合物研究較少[22]。為此，該研究對傳統(tǒng)山西老陳醋中的功能性成分一苯乳酸開展了系統(tǒng)分析，并進一步對市售食醋進行分析，確定PLA廣泛存在釀造食醋中。本研究發(fā)掘了食醋新的功能化合物，為食醋新功能的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品

山西老陳醋發(fā)酵過程中的樣品：由山西老陳醋集團有限公司、山西紫林醋業(yè)股份有限公司提供。77種食醋樣品：中國食醋樣品由各廠家提供或購買于超市；國外食醋樣品由瑞士日內瓦大學（Université de Genève）的Fran?ois Barja教授、意大利摩德納雷焦艾米里亞大學（University of Modena and Reggio Emilia）的Paolo Giudici教授、西班牙科多巴大學（University of Cordoba）的Isidoro García García教授提供或購買于瑞士和法國等國家的超市。

1.1.2 主要試劑

氘代甲醇：美國Sigma-Aldrich公司；PLA標準品（純度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇、甲酸和乙腈等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

600MHz DD2超導核磁共振波譜儀、Agilent 1100 液相二級質譜：美國Agilent公司；LC-6AD半制備高效液相色譜儀、LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；SIM CVCFD5冷凍干燥機：美國西盟國際公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制備山西老陳醋的乙酸乙酯萃取物

參照CHEN H等[23]的方法，制備山西老陳醋的乙酸乙酯提取物。1 kg山西老陳醋經冷凍干燥后，加入1 L無水乙醇，超聲提?。?00 W）30 min，重復5次，合并乙醇提取液。于35 ℃真空濃縮后，以蒸餾水稀釋，定容至0.5 L，再以0.5 L的乙酸乙酯萃取，重復3次，合并萃取液。于35 ℃真空濃縮至干，濃縮物以無水乙醇定容至1 L，用于食醋成分的分離。

1.3.2 乙酸乙酯提取物的分離制備

將乙酸乙酯提取物通過半制備高效液相色譜分離得到7個組分，V1～V7。液相色譜條件：Inertsil ODS-3 色譜柱（5 μm，14 mm×250 mm）；流動相：水∶甲醇=50∶50（V/V），洗脫時間：25 min；流速：6 mL/min；進樣量：50 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：280 nm。

由于只有V7組分的峰形單一，因此收集V7組分，真空濃縮去除甲醇后，凍干并保存于-20 ℃，備用。

1.3.3 V7組分的LC-MS/MS鑒定

參照陳亨業(yè)[24]報道的方法，采用液相色譜-串聯(lián)質譜（liquidchromatogram-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS）對上述制備得到的V7組分進行純度和質荷比信息的測定。LC-MS/MS條件：SpursilC18-EP色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相：甲酸水溶液（0.1%）∶甲醇為65∶35（V/V）；洗脫時間：60 min；流速：1 mL/min；進樣量：5 μL；質譜離子化模式：電噴霧離子化負離子模式；質荷比檢測范圍：50～800 m/z。

1.3.4 V7組分的核磁共振鑒定

由1.3.3的分析結果發(fā)現(xiàn)，在1.3.2中半制備高效液相色譜儀制備得到的V7組分純度高，成分單一，因此采用核磁共振對其進行了進一步分析。具體方法為以氘代甲醇將V7組分溶解后，通過一維的1H譜、13C譜和DEPT-135譜以及二維的1H-1H COSY譜、1H-13C HSQC譜和1H-13C HMBC譜，對其結構進行解析。

1.3.5 食醋PLA含量測定

采用高效液相色譜法對各食醋樣品中的PLA含量進行了測定，以PLA標準品為外標。食醋樣品經適當稀釋，高速離心（2 000×g，5 min）后過0.22 μm濾膜，濾液直接進樣。高效液相條件：Spursil C18-EP 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%的甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脫程序：0～15 min，80%A；15～17 min，10%A；17～20 min，10%A；20.01～25 min，80%A；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：205 nm。

1.3.6 數(shù)據分析

所有實驗數(shù)據均用Excel 2010分析，并以平均值或平均值±標準差表示?；衔锏姆肿咏Y構式采用Chembio Draw Ultra 12.0繪制。

2 結果與分析

2.1 山西老陳醋乙酸乙酯萃取物中組分的分離

預備實驗發(fā)現(xiàn)山西老陳醋的乙醇提取物組成成分非常復雜，故本研究將食醋的乙醇提取物用乙酸乙酯萃取后，再通過半制備高效液相色譜進行分離和制備。結果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯萃取物大致可分為V1～V7共7個組分，結果見圖1。其中V1～V6的組分成分仍非常復雜，而V7組分相對比較單一（見圖1），故后續(xù)僅收集V7組分進行進一步分離鑒定。

圖1 山西老陳醋乙酸乙酯萃取物中的組分分離Fig.1 Separation of components from ethyl acetate extract of Shanxi aged vinegar

2.2 V7組分中化合物的結構鑒定

采用LC-MS/MS和核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）的一維和二維譜對上述得到的V7組分化合物的化學結構進行了解析。該化合物的LC-MS/MS分析（圖2）與NMR的1H-13C HMBC鑒定（圖3）結果一致，而且NMR還進行了1H、13C，DEPT-135、1H-1H COSY、1H-13C HSQC分析，結果與1H-13C HMBC鑒定結果也完全一致（結果未顯示）。由LC-MS/MS和NMR分析結果判定V7化合物為苯乳酸。

圖2 V7化合物的LC-MS/MS分析結果Fig.2 LC-MS/MS analysis results of V7 component

圖3 V7組分的1H-13C HMBC核磁共振光譜圖Fig.3 NMR spectra of V7 component by 1H-13C HMBC spectrum

2.3 PLA在食醋生產過程中的變化

圖4 山西老陳醋發(fā)酵過程中苯乳酸濃度的變化Fig.4 Phenyllactic acid concentration of Shanxi aged vinegar during the fermentation process

對山西老陳醋PLA的來源進行探討，發(fā)酵過程中PLA質量濃度的變化結果見圖4。在山西老陳醋原輔料，包括高粱、谷殼、大麥等未檢測到PLA（結果未顯示）。由圖4可知，PLA主要產生于乙醇和醋酸發(fā)酵過程，特別是進入醋酸發(fā)酵階段，PLA含量明顯提高，而煎醋過程對PLA無明顯影響。

2.4 食醋中PLA的分析

由2.3的分析結果可知，山西老陳醋中的PLA可能主要來自發(fā)酵微生物，故推測其他食醋也應該含有PLA。本研究采集了來自9個不同國家的77種谷物醋和果醋，采用高效液相色譜法對PLA的含量進行了分析。以外標法確定PLA含量與峰面積的標準曲線為y=34 715x-49.887（R2=0.999 2），測得食醋樣品檢測結果見表1。結果顯示，在73種食醋中均檢測到PLA，其中谷物醋中PLA的含量（0～979.97 mg/L）普遍高于果醋中的含量（0～22.77 mg/L），尤其是我國傳統(tǒng)發(fā)酵的谷物醋。

表1 各種食醋中苯乳酸的含量Table 1 Phenyllactic acid contents in different vinegars

續(xù)表

3 討論

本研究在分析山西老陳醋功能成分時發(fā)現(xiàn)了PLA，并在來自不同國家的73個食醋樣品中均檢測到PLA，說明PLA普遍存在于釀造醋中。苯乳酸是一種光譜的生物防腐劑，所以食醋能夠用于消毒和食品防腐等[22]，可能與食醋中存在PLA有關。

目前報道產PLA的微生物以乳酸菌居多，特別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[11，25]。本研究發(fā)現(xiàn)我國以傳統(tǒng)方法釀造的食醋中PLA的濃度皆高于果醋，還高于其他發(fā)酵食品，如中國泡菜[26]和酸面團[27]，這應該與食醋釀造過程參與的微生物類群豐富，代謝過程更復雜有關。采用高通量測序分析山西老陳醋[28]、鎮(zhèn)江香醋[29]以及天津獨流陳醋[30]的微生物菌群，主要微生物均為乳酸桿菌屬的植物乳桿菌和醋桿菌屬的巴斯德醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），低豐度微生物在不同地域食醋釀造過程中有所不同。本研究對山西老陳醋PLA的來源進行探究，發(fā)現(xiàn)PLA雖然在乙醇發(fā)酵階段開始產生，但產量不高，而進入醋酸發(fā)酵階段，PLA的含量顯著增加。所以推測乳酸菌對PLA的產生起到了一定作用，醋酸菌作為醋酸發(fā)酵階段主要產酸微生物，應該發(fā)揮了積極的作用。

傳統(tǒng)釀造的食醋具有多種生理功能，但對應的功能成分知之不多[21]。本研究盡管首次確定山西老陳醋乙酸乙酯提取物中V7組分為PLA，但其他組分是什么，具有什么功能，還有待進一步研究。

4 結論

本研究從山西老陳醋中發(fā)掘到一種具有廣譜抑菌功能的化合物—PLA，并初步證實PLA是食醋釀造過程中產生的。在此基礎上，分析發(fā)現(xiàn)PLA普遍存在于釀造食醋中，且谷物醋中的PLA明顯高于果醋，特別是我國傳統(tǒng)四大名醋中PLA含量非常豐富。本研究成果豐富了食醋的功能成分譜，為開發(fā)食醋功能，增加食醋的附加值提供了新思路。