徐登圓，趙珊珊，竇俊，方宏清，徐曉峰，支艷艷，李曉穩(wěn)，文良柱

1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198；2.江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是革蘭陰性菌，感染率極高，95%的胃病由它引起，甚至導(dǎo)致胃癌[1-2]。目前，臨床多采用抗生素治療幽門螺桿菌感染，最常用的治療方法是標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法和四聯(lián)療法，例如鉍劑+甲硝唑+四環(huán)素+奧美拉唑、奧美拉唑+阿莫西林+克拉霉素、鉍劑+替硝唑+克拉霉素等[3]。這些治療方法患者依從性差，且由于抗生素的濫用，幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性問題越來越嚴(yán)重。經(jīng)過多年研究和開發(fā)，很難篩選出新的抗生素，抗生素已無法滿足臨床對于抗幽門螺桿菌感染的治療需求。因此，當(dāng)務(wù)之急是尋找一種新型抗菌制劑來應(yīng)對耐藥菌的威脅，迫切需要新型藥物替代傳統(tǒng)療法，以達(dá)到根治幽門螺桿菌的目的。

噬菌體是一種細(xì)菌病毒，廣泛存在，特異性高，易于分離獲得。但噬菌體是一個(gè)獨(dú)立的生命體，當(dāng)它直接用作抗菌制劑時(shí)，生物安全性一直飽受質(zhì)疑[4]。噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)由裂解酶和穴蛋白組成，是雙鏈DNA噬菌體在侵染細(xì)菌后期所表達(dá)的水解酶[5]。研究認(rèn)為噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，在殺滅病原菌的同時(shí)不會干擾正常菌群；不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，由于裂解酶是噬菌體在與細(xì)菌共同進(jìn)化過程中產(chǎn)生的，針對細(xì)菌細(xì)胞壁上高度保守的肽聚糖，所以產(chǎn)生耐藥性的幾率很?。粵]有噬菌體的增殖能力；具有高效的殺菌機(jī)制，能在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)菌[6]。

噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的作用機(jī)制分為體內(nèi)裂解和體外裂解。體內(nèi)裂解時(shí)先由穴蛋白在宿主細(xì)胞膜打孔，之后裂解酶作用于細(xì)胞壁進(jìn)而裂解細(xì)菌。體外裂解時(shí)由裂解酶直接作用于細(xì)胞壁，進(jìn)而裂解細(xì)菌。由于革蘭陽性菌與陰性菌之間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，其各自的裂解酶也存在明顯差異。目前，革蘭陽性菌噬菌體裂解酶發(fā)展較為成熟，可利用結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)，其中包括2個(gè)模塊，即細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域（可用于細(xì)菌細(xì)胞壁識別）和酶催化活性結(jié)構(gòu)域（發(fā)揮酶促活性作用，裂解肽聚糖結(jié)構(gòu)中的特異性鍵）[7-9]。針對革蘭陰性菌為宿主的噬菌體裂解酶主要是單域球狀蛋白，分子較小（相對分子質(zhì)量為15 000～20 000），通常沒有特定的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域模塊[10]。相比于陽性菌的噬菌體裂解酶，陰性菌噬菌體裂解酶可能會更好地發(fā)揮酶的催化作用[11]。細(xì)菌裂解后，不會被細(xì)胞壁碎片緊密地結(jié)合，一定程度上可脫落進(jìn)而裂解下一個(gè)宿主菌。而對于革蘭陰性菌，細(xì)胞壁周圍存在細(xì)菌外膜（outer membrane，OM），可以限制裂解酶從外部進(jìn)入肽聚糖層。目前，對于幽門螺桿菌噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的研究較少。因此，探究幽門螺桿菌噬菌體雙組分裂解系統(tǒng)的生物學(xué)特性，并將其與外膜滲透劑聯(lián)用，或?qū)ζ溥M(jìn)行修飾改造以達(dá)到穿透外膜的效果是目前的研究方向[12]。

我們根據(jù)已公開的幽門螺桿菌噬菌體KHP30的全基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件分析可能的雙組分裂解系統(tǒng)基因序列，并在其N端連上一段具有穿透外膜作用的疏水性多肽GFFIPAVILPSIAFLIVP，得到改良型幽門螺桿菌噬菌體裂解酶（下文簡稱改良型裂解酶），經(jīng)密碼子優(yōu)化后，分別在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母X33中表達(dá)，并在體外驗(yàn)證其溶菌活性差異，為其在抗幽門螺桿菌感染中的應(yīng)用與發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）、DH5α，畢赤酵母 X33購自MERCK公司；幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392購自上海北諾生物科技有限公司；質(zhì)粒pSUMO和pGAPZαA購自淼靈生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；幽門螺桿菌固體及液體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；溶菌酶購自SIGMA公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JFCH280制冷搖床、SW-CJ-1FD超凈工作臺（上海京孚儀器有限公司）；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、基因?qū)雰x（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速超低溫冷凍離心機(jī)（ThermoFisher Scientific公司）；AKTA蛋白純化儀（GE公司）；伯樂電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體pSUMO-改良型裂解酶和pGAPZαA-改良型裂解酶

在改良型裂解酶N端再連上一段VDDDK腸激酶酶切位點(diǎn)基因，按照大腸桿菌BL21（DE3）系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將設(shè)計(jì)的改良型裂解酶基因交由金斯瑞公司合成并亞克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，通過XhoⅠ和SacⅠ連接入pSUMO載體，得到重組表達(dá)載體pSUMO-改良型裂解酶。

在改良型裂解酶N端連上Kex2、Ste13酶切位點(diǎn)KREAEA，按照畢赤酵母X33系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過XhoⅠ和XbaⅠ連接入pGAPZαA載體，且目的基因中不能有AvrⅡ和BspHⅠ線性化酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)的基因交由南京金斯瑞公司合成并亞克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，得到重組表達(dá)載體pGAPZαA-改良型裂解酶。

1.3 構(gòu)建重組工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶

采用氯化鈣法制備大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，熱擊法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pSUMO-改良型裂解酶，經(jīng)卡那霉素抗性篩選及測序驗(yàn)證得到重組工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶。

1.4 構(gòu)建重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶

采用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，熱擊法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGAPZαA-改良型裂解酶，經(jīng)博來霉素抗性篩選得到重組工程菌DH5αpGAPZαA-改良型裂解酶。利用重組工程菌DH5α-pGAPZαA-改良型裂解酶富集重組質(zhì)粒，經(jīng)AvrⅡ酶切回收得到10 μg線性化質(zhì)粒L-pGAPZαA-改良型裂解酶。采用山梨醇法制備畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化L-pGAPZαA-改良型裂解酶，經(jīng)博來霉素抗性篩選及測序驗(yàn)證得到重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶。

1.5 2種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)與純化改良型裂解酶

取300 μL工程菌BL21（DE3）-pSUMO-改良型裂解酶甘油菌，接種于30 mL LB培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床過夜活化后，全部轉(zhuǎn)接于3 L LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至菌液D600nm值約1.0時(shí)，加入IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，20℃誘導(dǎo)12 h進(jìn)行改良型裂解酶的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后8500 r/min離心20 min收獲菌體沉淀，用Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）洗滌沉淀2次，將沉淀重懸于30 mL Tris-HCl緩沖液中，并使用冰浴在低于10℃的溫度下超聲波破碎細(xì)胞（400 W，超聲 5 s，間隔 10 s，工作 180次），收集上清液（超聲處理后的可溶性蛋白）和沉淀物（溶解在8 mol/L尿素中），取同等體積樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析[16-17]。

將收集得到的超聲破菌上清液經(jīng)Ni-NAT填料進(jìn)行親和層析柱純化，用20個(gè)柱體積的含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫柱子，按0～100%，40個(gè)柱體積進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰，測蛋白濃度并進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證[18]。

收集得到的洗脫峰采用腸激酶進(jìn)行酶切激活，將脫鹽后的SUMO-改良型裂解酶融合蛋白經(jīng)腸激酶（1∶200）在室溫下過夜即可得到具有活性的改良型裂解酶，并進(jìn)行電泳分析。

另外，取100 μL重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶甘油菌接種入10 mL YPD培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)過夜，取過夜活化的菌液100 μL轉(zhuǎn)接入50 mL YPD培養(yǎng)基中，裝液量為20%，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)。分別在0、24、48、72和96 h取樣1 mL離心收集上清液，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。在表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)，以8500 r/min離心20 min收集發(fā)酵液上清，上清采用3K超濾濃縮，用50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）置換體系3次，得到改良型裂解酶粗提溶液[19]。

1.6 濾紙片法抑菌試驗(yàn)

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境（50 mL/L O2，100 mL/L CO2，850 mL/L N2）中培養(yǎng)72 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，混勻[20]。采用快速尿素酶試驗(yàn)（rapid urease test，RUT）、過氧化氫酶試驗(yàn)和涂片革蘭染色后顯微鏡下觀察等對菌種進(jìn)行鑒定[21]。鑒定為陽性的菌液用滅菌生理鹽水溶液溶解，酶標(biāo)儀測定D600nm值為4.8～8.4之間，即得1×109CFU/mL的菌液。取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，將幽門螺桿菌菌液均勻涂布在其表面，用無菌鑷子貼加濾紙片，向?yàn)V紙片上滴加30 μL藥液，37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h觀察平板是否有抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

陽性對照為2 mg/mL溶菌酶；陰性對照為50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）；樣品分別采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的改良型裂解酶，濃度均為2 mg/mL。

1.7 電鏡觀察幽門螺桿菌裂解狀態(tài)

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h，用PBS緩沖液洗下菌苔，2000 r/min離心5 min收集菌體，菌體中加入1 mg/mL溶菌酶及改良型裂解酶，以加入緩沖液50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）為陰性對照組。搖床孵育20 min，取樣離心后用2.5%戊二醛固定液和1%鋨酸固定液固定，再經(jīng)脫水干燥后進(jìn)行電鏡觀察。

1.8 液體法抑菌試驗(yàn)

取幽門螺桿菌固體培養(yǎng)基，平板劃線接種幽門螺桿菌ATCC700392培養(yǎng)物，于37℃、微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h，用滅菌幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基洗下菌苔，混勻。取250 μL菌液加入比色皿，酶標(biāo)儀測其D600nm值。在四分格平板中加入藥液及菌液，使菌液D600nm值為0.55，且溶菌酶濃度為1 mg/mL，樣品濃度為0.5 mg/mL，以加入緩沖液50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）為陰性對照組，總體積為2 mL。將四分格平板放入2.5 L厭氧罐，厭氧罐內(nèi)放入微需氧產(chǎn)氣袋，再將厭氧罐放入搖床，37℃、150 r/min 培養(yǎng)[22]。在 0、6、24、30 h 分別取樣200 μL，酶標(biāo)儀測其D600nm值，繪制柱狀裂菌效果圖。

2 結(jié)果

2.1 改良型裂解酶生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件分析推測的幽門螺桿菌噬菌體穴蛋白和裂解酶相對分子質(zhì)量分別為12 090和16 870。基于二者設(shè)計(jì)的改良型裂解酶相對分子質(zhì)量為31 350，等電點(diǎn)為9.1。其中穴蛋白存在3段跨膜區(qū)域，改良型裂解酶不含信號肽序列，且無相似的三級結(jié)構(gòu)模型。

2.2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）表達(dá)改良型裂解酶

重組質(zhì)粒pSUMO-改良型裂解酶成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)卡那霉素抗性篩選和測序驗(yàn)證得到重組工程菌BL21-pSUMO-改良型裂解酶，經(jīng)3 L培養(yǎng)基發(fā)酵后得到12 g菌體。誘導(dǎo)前后全菌電泳在相對分子質(zhì)量約45 000處條帶有一定的加深，但并不明顯，可能由于蛋白可溶性表達(dá)量低（圖1）。超聲波破菌后，SUMO-改良型裂解酶融合蛋白多存在于上清中，沉淀中基本無（圖2）。破菌上清液經(jīng)Ni柱純化，在咪唑濃度為25 mmol/L時(shí)有較純的洗脫峰，得到較純的融合蛋白（圖3）。SUMO-改良型裂解酶融合蛋白經(jīng)超濾脫鹽后，由腸激酶酶切得到粗純的改良型裂解酶，濃度為2 mg/mL，純度約80%（圖4）。由于改良型裂解酶具有一定的酶活性，不再多次反復(fù)進(jìn)行純化，直接用粗純液進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。

圖1 菌體誘導(dǎo)前后電泳圖

圖2 超聲破菌后電泳圖

圖3 Ni柱純化電泳圖

圖4 腸激酶激活改良型裂解酶電泳圖

2.3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)X33表達(dá)改良型裂解酶

重組質(zhì)粒pGAPZαA-改良型裂解酶電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，經(jīng)博來霉素抗性篩選和測序驗(yàn)證，得到重組工程菌X33-pGAPZαA-改良型裂解酶。該重組工程菌由組成型GAP啟動子表達(dá)目的蛋白，不需要甲醇誘導(dǎo)。在50 mL YPD培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h時(shí)，改良型裂解酶表達(dá)量最高，此時(shí)蛋白濃度為0.04 mg/mL（圖5）。發(fā)酵液上清3k超濾濃縮并置換體系得到濃度為2 mg/mL的改良型裂解酶粗體液，純度達(dá)80%以上（圖6）。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液上清電泳圖

圖6 3k超濾前后電泳圖

2.4 2種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的改良型裂解酶體外活性分析

2.4.1 濾紙片法 濾紙片法證明由大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)得到的改良型裂解酶均可以裂解幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392。在濃度為2 mg/mL時(shí)，大腸桿菌表達(dá)的改良型裂解酶可形成直徑約0.75 cm的抑菌圈，而畢赤酵母表達(dá)的改良型裂解酶可形成直徑約0.5 cm的抑菌圈（圖7）。初步證實(shí)了改良型裂解酶對幽門螺桿菌具有一定的裂菌活性，且對于裂菌活性而言，大腸桿菌表達(dá)的改良型裂解酶強(qiáng)于畢赤酵母。由于幽門螺桿菌本身呈透明片狀生長，且血瓊脂平板底色過深，肉眼可觀察到明顯的抑菌圈，但拍照得到的圖片無法準(zhǔn)確顯示結(jié)果。

圖7 改良型裂解酶濾紙片法抑菌效果

2.4.2 電鏡觀察 在改良型裂解酶和幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392共同搖床孵育20 min后，電鏡可觀察到幽門螺桿菌表面有明顯的孔洞，菌體周圍出現(xiàn)病變的絲狀物，整個(gè)視野里存在細(xì)菌碎片（圖8）。進(jìn)一步證實(shí)了改良型裂解酶對幽門螺桿菌的裂菌作用。大腸桿菌表達(dá)的改良型裂解酶和幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700392共同搖床孵育20 min時(shí)，對幽門螺桿菌產(chǎn)生的裂菌作用更強(qiáng)，在幽門螺桿菌表面形成的孔洞較畢赤酵母表達(dá)的改良型裂解酶更多，且更多的菌體形成球狀的近溶菌狀態(tài)，而畢赤酵母表達(dá)的改良型裂解酶作用后菌體大多仍呈桿狀。

圖8 改良型裂解酶裂解菌體電鏡圖

2.4.3 液體法抑菌試驗(yàn)裂菌效果圖 幽門螺桿菌在液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，初始D600nm值為0.55，從培養(yǎng)6、24和30 h的D600nm值可以看出加入溶菌酶和改良型裂解酶的幽門螺桿菌生長受到抑制，相較于未加入二者之一的陰性對照，菌體生長差異明顯。且加入大腸桿菌表達(dá)的改良型裂解酶的幽門螺桿菌生長被抑制狀態(tài)與溶菌酶基本一致，而加入畢赤酵母表達(dá)的改良型裂解酶的幽門螺桿菌被抑制狀態(tài)稍弱于溶菌酶（圖9）。

圖9 改良型裂解酶對幽門螺旋桿菌的裂菌效果

3 討論

相對于抗生素的廣譜抗菌作用，從幽門螺桿菌噬菌體基因組獲得的裂解系統(tǒng)是特異且高效的[23]。噬菌體裂解系統(tǒng)對宿主細(xì)菌的裂解分為內(nèi)部裂解和外部裂解。外部裂解過程，即在宿主菌體外裂解細(xì)菌，主要適用于革蘭陽性細(xì)菌，因?yàn)楦锾m陽性菌的肽聚糖層直接暴露于外部，有利于裂解酶和肽聚糖的直接接觸和作用；而用于革蘭陰性菌裂解酶的研究面臨很大的問題，主要原因是裂解酶的靶標(biāo)是細(xì)胞壁的肽聚糖成分，而革蘭陰性肽聚糖層周圍的細(xì)菌外膜阻礙了裂解酶與肽聚糖之間的接觸，使得它不起作用。然而，經(jīng)過研究人員的不斷研究和努力，革蘭陰性菌溶菌素的問題可以通過以下方式解決：①尋找并確定可以穿透外膜的天然裂解酶；②利用溶血素與EDTA、檸檬酸、蘋果酸和陽離子肽等外膜滲透劑的協(xié)同作用，促進(jìn)裂解酶的裂解效果；③融合蛋白表達(dá)可穿透外膜的肽等[17,24]。本研究中，我們從幽門螺桿菌噬菌體KHP30中篩選得到可有效裂解幽門螺桿菌的雙組分裂解系統(tǒng)即噬菌體穴蛋白和裂解酶，通過設(shè)計(jì)改造得到改良型裂解酶基因，采用穴蛋白-裂解酶和疏水多肽的融合表達(dá)來達(dá)到穿透外膜并裂解幽門螺桿菌的效果。在以后的研究中，可以設(shè)計(jì)更多具有膜滲透性的多肽，進(jìn)而篩選出融合表達(dá)后具有更好裂解效果的改良型裂解酶。

本研究分別構(gòu)建了具有裂解幽門螺桿菌作用的改良型裂解酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母X33中的表達(dá)載體，并表達(dá)出改良型裂解酶。大腸桿菌中的表達(dá)載體pSUMO-改良型裂解酶須IPTG誘導(dǎo)，在胞內(nèi)可溶性表達(dá)，需要經(jīng)過破菌處理和Ni柱純化再酶切激活，才能得到改良型裂解酶粗提物；而畢赤酵母中的表達(dá)載體pGAPZαA-改良型裂解酶無須誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，由組成型GAP啟動子表達(dá)改良型裂解酶，直接分泌到胞外，發(fā)酵上清處理后可得到改良型裂解酶粗提物。因此，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在培養(yǎng)發(fā)酵及純化方面更具優(yōu)勢，簡單方便，有利于工業(yè)規(guī)模放大生產(chǎn)。然而，體外活性檢測試驗(yàn)表明在相同濃度等條件下，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的改良型裂解酶的裂菌效果強(qiáng)于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的改良型裂解酶?？赡苡捎谟拈T螺桿菌與大腸桿菌均屬于原核細(xì)菌，親緣性更近，表達(dá)的作用于原核細(xì)菌的蛋白酶活性更強(qiáng)；而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)的外源蛋白可進(jìn)行糖基化等修飾，可能會對改良型裂解酶的活性有所影響。研究者可根據(jù)不同的試驗(yàn)需求選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)，為治療幽門螺桿菌新型制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。自然界廣泛存在噬菌體，大量的噬菌體裂解酶有待發(fā)現(xiàn)探索。對于難以攻克的革蘭陰性菌噬菌體裂解酶，也可以通過基因重組技術(shù)設(shè)計(jì)改造，將其發(fā)展為新的生物酶抗菌制劑，用于治療新出現(xiàn)的革蘭陰性超級耐藥細(xì)菌造成的感染[12,25-26]。