編譯 莫莊非

在我們體內(nèi)，簡(jiǎn)單的糖（例如葡萄糖、甘露糖和巖藻糖）連接在一起，形成了復(fù)雜的多糖（或者說(shuō)聚糖），這些多糖修飾著細(xì)胞的表面，形成了一層厚厚的“糖衣”，但與基因組和蛋白質(zhì)組不同，那些“糖衣”中的糖組目前對(duì)我們來(lái)說(shuō)仍是待解之謎，部分原因是聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)太過(guò)復(fù)雜。我們的身體合成了數(shù)千種獨(dú)特的聚糖，但是很少有分析方法可以有效地闡明其結(jié)構(gòu)。與線性組裝的DNA和蛋白質(zhì)不同，聚糖高度支化，使其難以合成。當(dāng)然，智慧的化學(xué)科學(xué)家正幫助我們更趨近于破解糖的編碼。

寡糖主要附著在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上，這一事實(shí)過(guò)去一直被生物學(xué)研究忽略。但美國(guó)佐治亞大學(xué)的吉爾特-簡(jiǎn)·布恩斯（Geert-Jan Boons）表示寡糖應(yīng)該引起研究者的重視：“我認(rèn)為在過(guò)去的十年中，寡糖幾乎參與了機(jī)體的每一個(gè)健康與疾病的過(guò)程?！奔?xì)胞的糖衣可以提供獨(dú)特的細(xì)胞條形碼使免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別其他細(xì)胞（包括外來(lái)入侵者）。一個(gè)公認(rèn)的事實(shí)是，異常的糖基化似乎會(huì)推動(dòng)癌癥發(fā)展，特別是高度唾液酸化作用——因?yàn)橥僖核崽呛窟^(guò)高。唾液酸糖連接于聚糖鏈的最外層，主鏈上有9個(gè)碳原子。

對(duì)于專業(yè)研究者來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期研究目標(biāo)是完整定義糖組學(xué)這一概念。所謂糖組學(xué)，是研究在細(xì)胞或生物體中產(chǎn)生的整套聚糖的結(jié)構(gòu)和功能。但是，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的碳水化合物化學(xué)家薩賓·弗利奇（Sabine Flitsch）認(rèn)為這項(xiàng)工作比定義基因組或蛋白質(zhì)組更復(fù)雜一些，她解釋說(shuō)道：“糖組不是由基因組直接編碼的，你無(wú)法將糖的結(jié)構(gòu)與一種特定的蛋白質(zhì)（或基因）聯(lián)系起來(lái)。糖基化（即聚糖的添加）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄后修飾的過(guò)程，組裝糖的200多種酶不提供模板。酶與糖核苷酸的可利用性決定了生物合成的結(jié)構(gòu)類型?！?/p>

除了不由基因組直接編碼，聚糖數(shù)量過(guò)多也是研究的障礙。用10種常見的單糖去組合聚糖，可能的組合結(jié)構(gòu)數(shù)量要比DNA或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)數(shù)量多得多。由6個(gè)糖分子組成的六糖可以有1 930億個(gè)可能的結(jié)構(gòu)。另外，聚糖的種類很多，包括與氨基酸天冬酰胺連接的N-連接寡糖，與蘇氨酸或絲氨酸連接的O-連接寡糖，以及糖胺聚糖——長(zhǎng)鏈的高極性多糖，可作為生物潤(rùn)滑劑（例如肝素和血液，以及防止血凝塊的血液稀釋劑）。

合成挑戰(zhàn)

從自然界中提取純的聚糖通常是不可能的，因此化學(xué)家們需要合成大量可能的聚糖。這并不容易，因?yàn)樗鼈冇卸喾N異構(gòu)形式。聚糖有非常多的單糖排列方式和支化結(jié)構(gòu)。異構(gòu)體可以是基于不同的環(huán)尺寸和不同的取代位置（區(qū)域異構(gòu)體）的。弗利奇說(shuō)道：“你還必須正確理解連接的立體化學(xué)——是α連接還是β連接，這可能是最大的挑戰(zhàn)之一。”在糖基化中，碳水化合物（糖基供體）與另一個(gè)糖（糖基受體）的羥基相連，形成異頭碳，從而允許在兩種可能的構(gòu)型之間轉(zhuǎn)化。最終產(chǎn)物可以是α或β構(gòu)型。弗利奇解釋說(shuō)：“只有進(jìn)行大量的保護(hù)基化學(xué)反應(yīng)，才能獲得化學(xué)選擇性。每個(gè)偶聯(lián)步驟需要大約7個(gè)化學(xué)步驟。”

一種提升速度的方法是使用堅(jiān)固的支撐架來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。彼得·西伯格（Peter Seeberger）來(lái)自德國(guó)波茨坦的馬克斯·普朗克膠體與界面研究所，他于2013年創(chuàng)立了糖宇宙（GlycoUniverse）公司。該公司開發(fā)了一種全自動(dòng)寡糖合成儀Glyconeer，目前在全球范圍內(nèi)已有8臺(tái)投入使用。糖宇宙的科學(xué)負(fù)責(zé)人馬里奧·薩爾維切克（Mario Salwiczek）解釋說(shuō)道：“Glyconeer能固態(tài)合成寡糖，其中訣竅在于第一個(gè)結(jié)構(gòu)單元連接到不溶的聚合物上——在大多數(shù)情況下，是聚苯乙烯微珠。好處在于你可以除掉所有尚未反應(yīng)的反應(yīng)物或已形成的所有副產(chǎn)物，而不必在每個(gè)偶聯(lián)之間進(jìn)行純化步驟。”

西伯格用這種方法制成的最長(zhǎng)糖鏈?zhǔn)蔷€型的50糖寡糖（50-sugar oligosaccharide），更典型的寡糖是6～10個(gè)單糖分子脫水縮合而成的?！昂苊黠@，這項(xiàng)技術(shù)本身無(wú)法解決我們面對(duì)的化學(xué)問(wèn)題，”西伯格指出，“一種策略是開發(fā)多種糖的通用結(jié)構(gòu)單元?！辈级魉拐f(shuō)：“我們想出的解決方案是巧妙地選擇結(jié)構(gòu)單元。寡糖在結(jié)構(gòu)上非常復(fù)雜，但是如果仔細(xì)觀察，就會(huì)發(fā)現(xiàn)它們以不同的方式組合在一起形成某些特定構(gòu)型?！?/p>

布恩斯和其他人已經(jīng)合成出了此類構(gòu)型的聚糖，它們能通過(guò)多種方式進(jìn)行組裝。他用這種方法合成了由20種二糖制成的合成肝素，而這20種二糖僅僅由6種不同的單糖組裝而成。

生物催化

另一個(gè)重要進(jìn)步是使用了糖基轉(zhuǎn)移酶，它能將單糖從活化的糖單磷核苷酸或糖二磷核苷酸轉(zhuǎn)移到寡糖鏈。20世紀(jì)80年代，該方法被證明可用于合成復(fù)雜的聚糖，其中每個(gè)鍵由不同的酶合成。

弗利奇表示：“糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)勢(shì)在于，它們可以完全照顧到所有區(qū)域及立體選擇性。它們要用2個(gè)通用的結(jié)構(gòu)單元，并以非常特定的方式發(fā)揮組合作用。建構(gòu)出α-或β-端基異構(gòu)體取決于核苷酸受體是什么。機(jī)器內(nèi)部的化學(xué)合成需要7個(gè)步驟，而這個(gè)操作其實(shí)一步就夠了。化學(xué)家可以通過(guò)碳水化合物活性酶（CAZy酶）的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)輔助設(shè)計(jì)合成方法。對(duì)于這些生物合成所需要的酶，我們已經(jīng)有了很深入的了解?！?/p>

布恩斯說(shuō)：“五六年前，這類合成工作基本要靠博士來(lái)完成，而現(xiàn)在，我們大家在周末就可以做。不過(guò)缺點(diǎn)是，如果你想建構(gòu)一個(gè)非自然的結(jié)構(gòu)，或者具有更多類藥性的結(jié)構(gòu)是存在困難的，因?yàn)槊覆⒉簧瞄L(zhǎng)?！辈级魉挂恢迸νㄟ^(guò)一些化學(xué)方法與酶的協(xié)同工作來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。例如，他僅用10個(gè)化學(xué)和酶促步驟就合成了具有多達(dá)4個(gè)不同分支的N-聚糖。

他采用從蛋黃粉中分離出來(lái)的對(duì)稱雙觸角糖基衍生物作為結(jié)構(gòu)單元；然后，他向其中添加了一個(gè)非天然的糖核苷酸供體——5'-二磷酸-N-三氟乙?；咸烟前罚玫揭粋€(gè)中間態(tài)結(jié)構(gòu)；當(dāng)使用酶進(jìn)一步延長(zhǎng)聚糖分支時(shí)，非天然分子對(duì)酶的作用呈惰性，因此進(jìn)一步的反應(yīng)選擇性地發(fā)生在了其他支鏈上；接著，非天然葡萄糖胺被轉(zhuǎn)化成了其天然對(duì)應(yīng)物，從而允許進(jìn)一步的酶促反應(yīng)。布恩斯稱該策略為“打打停?！?。他說(shuō)道：“我們真的相信酶和化學(xué)的結(jié)合正在革新創(chuàng)造這些分子的過(guò)程?！?/p>

怎樣分析合成物？

合成聚糖只是故事的一部分——對(duì)其進(jìn)行分析也至關(guān)重要，這不僅有助于定義人類糖組，對(duì)于生物制藥也很重要。許多生物藥物是糖基化的，例如促紅細(xì)胞生成素（EPO）這一臭名昭著的性能增強(qiáng)藥物。弗利奇說(shuō)：“如果不對(duì)它進(jìn)行糖基化，它就不會(huì)在人類體內(nèi)活躍?！钡治鼍厶墙Y(jié)構(gòu)并不簡(jiǎn)單，而且很難復(fù)制生物藥物。她補(bǔ)充說(shuō)：“非專利藥公司非?？释@得更好的分析方法。”

大多數(shù)現(xiàn)有的針對(duì)聚糖的分析技術(shù)都存在問(wèn)題。當(dāng)前的方法通常涉及與質(zhì)譜聯(lián)用的分離技術(shù)，但是色譜法設(shè)計(jì)時(shí)要考慮到肽。德國(guó)柏林自由大學(xué)的有機(jī)化學(xué)家凱文·佩吉爾（Kevin Pagel）表示：“糖比肽極性更大，結(jié)果，成熟的反相分離技術(shù)實(shí)際上對(duì)糖不起作用?！痹趩翁潜旧砑捌浣M成的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)現(xiàn)象（葡萄糖、半乳糖和果糖都通用），有時(shí)無(wú)法通過(guò)質(zhì)荷比進(jìn)行質(zhì)譜分析，NMR也無(wú)法區(qū)分立體化學(xué)細(xì)節(jié)。佩吉爾補(bǔ)充道：“分析簡(jiǎn)單的三糖可能非常具有挑戰(zhàn)性。”

N-聚糖更易于表征，但O-連接聚糖問(wèn)題很大。粘蛋白（mucins）是一種存在于黏液中的，具有很長(zhǎng)聚糖鏈的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)了密集糖基化且體積很大，它在表征方面也面對(duì)著巨大的挑戰(zhàn)。糖胺聚糖也很難表征，這也解釋了肝素分析遇到的問(wèn)題——2008年，受污染的肝素在全球造成200多人死亡，這是制造商使用了非活性化合物作為替代所導(dǎo)致的，而在常規(guī)測(cè)試中，這兩種物質(zhì)無(wú)法被區(qū)分。

弗利奇說(shuō)：“我們真正想要，也正在努力研發(fā)的是一種可以用于所有聚糖分析的通用技術(shù)。一種可能有用的技術(shù)是離子遷移譜（IMS）——機(jī)場(chǎng)安全部門用它來(lái)篩查爆炸物。將它與質(zhì)譜組合，可以根據(jù)物質(zhì)的質(zhì)量、電荷、大小和形狀來(lái)區(qū)分氣相離子。佩吉爾解釋說(shuō)：“不同的異構(gòu)體通常具有不同的大小和形狀，這使該方法成為表征聚糖的理想選擇?！?/p>

離子在弱電場(chǎng)的作用下被引導(dǎo)通過(guò)氦氣或氮?dú)?，它們的碰撞速率?huì)發(fā)生變化，較大的橫截面分子會(huì)更頻繁地碰撞且漂移時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)。IMS與質(zhì)譜聯(lián)用，可以區(qū)分較小的完整聚糖的不同異構(gòu)體。

在執(zhí)行離子遷移率測(cè)量之前，使用一組有限的標(biāo)準(zhǔn)片段指紋圖譜，對(duì)大的聚糖進(jìn)行片段化可以提供一種與通用測(cè)序方法相近的方法。弗利奇說(shuō)道：“這有點(diǎn)像霰彈槍定序法。”至關(guān)重要的是，碳水化合物片段似乎保留了其立體化學(xué)的記憶。她補(bǔ)充說(shuō)：“它看起來(lái)會(huì)有所不同，具體取決于它是來(lái)自α還是β連接——這是測(cè)序規(guī)程的又一關(guān)鍵步驟?！?/p>

另一個(gè)重要的進(jìn)步是紅外多光子離解（IRMPD）光譜。使用高強(qiáng)度激光，通過(guò)觀察鍵解離時(shí)吸收光子的過(guò)程，間接測(cè)量紅外光譜。使用質(zhì)譜測(cè)量碎裂產(chǎn)率（fragmentation yield）隨波長(zhǎng)的變化，可以得到振動(dòng)光譜。不過(guò)佩吉爾也指出了一個(gè)缺點(diǎn)：“在室溫下，所得光譜特征的可診斷性通常很差，因?yàn)樗鼈兺ǔ：軐挿??！?/p>

他接著說(shuō)道：“我們第一次是在超冷溫度下用糖做實(shí)驗(yàn)。我們獲得了振動(dòng)指紋，其分辨率非常好，這也使我們能夠弄清聚糖中的每一個(gè)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)?！蓖ㄟ^(guò)冷卻超流體氦液滴中的離子，佩吉爾等人將物質(zhì)的溫度降至-272.75℃，并使其處于一個(gè)極低的能態(tài)。他們明確地區(qū)分出了一系列三糖異構(gòu)體——在某些情況下，它們的區(qū)別僅在于單個(gè)羥基的立體化學(xué)性質(zhì)的不同。

那么結(jié)合這些新方法，聚糖測(cè)序會(huì)成為現(xiàn)實(shí)嗎？布恩斯說(shuō)：“我認(rèn)為我們已經(jīng)開始具備實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的綜合能力。”不過(guò)佩吉爾依然認(rèn)為，對(duì)完整的人類糖原進(jìn)行測(cè)序可能在20年后還會(huì)是一個(gè)挑戰(zhàn)。因?yàn)榕cDNA和蛋白質(zhì)不同，糖組是高度動(dòng)態(tài)的。弗利奇指出：“人體的糖組之間存在巨大的個(gè)體差異?！彪m然DNA的差異僅僅是每千個(gè)殘基出現(xiàn)一次，但糖組的差異是高度依賴于環(huán)境的。

微陣列

加拿大艾伯塔大學(xué)的拉拉·瑪哈爾（Lara Mahal）是聚糖微陣列研究領(lǐng)域的先驅(qū)，她對(duì)糖組的看法有所不同。瑪哈爾不確定我們是否真的需要它。她說(shuō)道：“很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，同行們一直覺得我們需要明確離散結(jié)構(gòu)以及這些結(jié)構(gòu)的每一個(gè)細(xì)節(jié)，但是如果你關(guān)注自然，就知道它不在乎是否有一個(gè)離散的結(jié)構(gòu)，它在乎的是一組可以實(shí)現(xiàn)特定功能的結(jié)構(gòu)。問(wèn)題在于，我們需要每個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)嗎？或者我們能夠了解子結(jié)構(gòu)的變化嗎？”

為此，瑪哈爾等人致力于開發(fā)可使用高通量自動(dòng)化研究糖蛋白相互作用的微陣列。這種陣列將各種聚糖排列在固定于支撐物上的微小斑點(diǎn)中，與聚糖結(jié)合蛋白、細(xì)胞甚至整個(gè)病毒群一起培育。他們使用熒光標(biāo)簽觀察結(jié)合過(guò)程。

19世紀(jì)初期，英國(guó)帝國(guó)理工學(xué)院的滕·菲茲（Ten Feizi）開發(fā)了第一種固定聚糖的方法。她將脂質(zhì)接頭連接到聚糖上，形成了“新糖脂”，然后可以將其固定在硝酸纖維素表面上。帝國(guó)理工學(xué)院糖類微陣列設(shè)備負(fù)責(zé)人劉燕（Yan Liu）說(shuō)：“采用共價(jià)陣列控制載玻片上的聚糖濃度并不容易。”如果聚糖太密集，或聚集方式不對(duì)，則結(jié)合的條件可能就有問(wèn)題。借助“新糖脂”，可以使聚糖以非共價(jià)鍵結(jié)合到基質(zhì)表面，而且這些聚糖似乎是能夠移動(dòng)和聚集的——這更好地模仿了細(xì)胞表面的聚糖排列。劉燕接著說(shuō)道：“這種形式對(duì)許多類型的內(nèi)源性和病毒性聚糖結(jié)合蛋白非常有用，對(duì)抗體也非常敏感?！?/p>

連接脂質(zhì)的第一種方法是伯胺基和聚糖之間的縮合反應(yīng)，但這會(huì)導(dǎo)致核心單糖的開環(huán)，對(duì)短鏈聚糖是不利的。2007年，劉燕設(shè)計(jì)了另一種肟連接法。他們對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行了修飾，使其包含一個(gè)氨基-氧基基團(tuán)，該基團(tuán)經(jīng)偶聯(lián)形成了一個(gè)穩(wěn)定的肟鍵（RHC =NOR'）。劉燕表示：“基于這種方法，我們通過(guò)提供短寡糖和核心支鏈聚糖來(lái)進(jìn)行配體結(jié)合研究，從而大大拓寬了基于‘新糖脂’的微陣列系統(tǒng)的范圍?！?/p>

帝國(guó)理工學(xué)院的聚糖庫(kù)是歐洲最大的，大約有1 000個(gè)序列，可供所有研究人員進(jìn)行測(cè)試，但人類可識(shí)別的聚糖可能有7 000種（實(shí)際數(shù)量尚不清楚）。劉燕說(shuō)道：“我認(rèn)為我們漏掉了很多。另一方面，我們擁有那些在許多識(shí)別系統(tǒng)中起著重要作用的聚糖的主要封端基團(tuán)?！?/p>

瑪哈爾采取的方法是使用微陣列查找疾?。òò┌Y）的生物標(biāo)記。19世紀(jì)中期，她開始研發(fā)外源凝集素——結(jié)合糖類的植物蛋白——的高通量陣列?，敼柦忉屨f(shuō)：“自然界已經(jīng)進(jìn)化出具有非常特殊的分子識(shí)別表面的蛋白質(zhì)。它們確實(shí)擅長(zhǎng)識(shí)別一些相似的分子結(jié)構(gòu)間的區(qū)別。例如α-2，6鍵與半乳糖鍵接的，與α-2，3鍵與半乳糖鍵接的唾液酸結(jié)構(gòu)間的差異就可被那些蛋白質(zhì)識(shí)別，而且是能夠立即分辨出來(lái)，可質(zhì)譜分析就無(wú)法輕易做到這一點(diǎn)。當(dāng)然，使用這種方法并不能確定精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)，但它為我們提供了一條確定糖的變化方式的快捷途徑?！?/p>

瑪哈爾的研究小組也一直在嘗試了解糖基化在生物學(xué)層面是如何被控制的。他們將其與微RNA（miRNA）聯(lián)系在一起?，敼栒J(rèn)為，這種機(jī)制控制著引發(fā)糖基化的轉(zhuǎn)移酶。她說(shuō)道：“我們?cè)噲D找出糖基化酶的完整miRNA調(diào)控過(guò)程，作為解決其中某些問(wèn)題的第一步?！?/p>

顯然，無(wú)論是要弄清糖組，還是搞明白基礎(chǔ)生物學(xué)，都還有很長(zhǎng)的路要走。弗利奇說(shuō)道：“我認(rèn)為碳水化合物化學(xué)確實(shí)將有機(jī)化學(xué)推到了極限?！辈贿^(guò)瑪哈爾也指出，不要把糖組學(xué)看成一座不可逾越的高山：“我認(rèn)為糖組學(xué)一直存在的問(wèn)題之一是，人們覺得它很難，而我會(huì)挑戰(zhàn)它……實(shí)際上，在生物學(xué)中又有什么是不復(fù)雜的呢？”