張 杰 賴潤(rùn)民 鞠建慶 陳 卓 徐 浩▲

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管科，北京 100091；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科，北京 100091

左心室射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）占臨床診斷心力衰竭患者的22%～73%[1]，其死亡率與射血分?jǐn)?shù)降低心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）相似[2]，且目前證據(jù)顯示尚無(wú)降低HFpEF 患者發(fā)病率或死亡率的有效方法[3]。中醫(yī)氣血理論認(rèn)為與HFrEF 陽(yáng)虛不得溫化水飲不同，HFpEF 的病機(jī)為氣虛血瘀終致水停，治療應(yīng)以益氣活血為法[4]。課題組前期薈萃分析證實(shí)[5]益氣活血法有助于改善HFpEF 患者心功能、E/A 比值及6 min 步行距離。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香組成，是益氣活血的代表方藥，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示[6-7]芪參益氣滴丸治療HFpEF 具有良好效果。然而，中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜、作用機(jī)制多樣，芪參益氣滴丸治療HFpEF 的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清晰。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法闡釋芪參益氣滴丸治療HFpEF 的潛在活性成分和作用機(jī)制，對(duì)于開(kāi)展深入的基礎(chǔ)研究和拓展臨床思路均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 芪參益氣滴丸活性成分與潛在靶點(diǎn)篩選

利用BATMAN-TCM 平臺(tái)（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）篩選黃芪、丹參、三七和降香的活性成分及潛在靶點(diǎn)基因。檢索參數(shù)設(shè)置為Score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05，建立活性成分-靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭的疾病靶點(diǎn)篩選

利用GeneCards（http：//www.genecards.org/）和PALM-IST 平臺(tái)（http：//www.hpppi.iicb.res.in/ctm/）篩選HFpEF 的疾病靶點(diǎn)基因，以“heart failure with preserved ejection fraction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索。

1.3 “藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化，利用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，將自由度≥10 的靶基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）進(jìn)行基因相互作用分析。

1.4 基因富集分析

將芪參益氣滴丸治療HFpEF 的靶基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org）進(jìn)行基因富集分析。以P ＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的篩選條件，設(shè)置min overlap=3，min enrichment=1.5，對(duì)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析及可視化。

2 結(jié)果

2.1 芪參益氣滴丸治療HFpEF 的活性成分和潛在靶點(diǎn)

經(jīng)BATMAN-TCM 平臺(tái)檢索，共獲得芪參益氣滴丸化學(xué)成分112 個(gè)，經(jīng)GeneCards 和PALM-IST 平臺(tái)檢索，共獲得人類HFpEF 疾病靶點(diǎn)基因804 個(gè)，取芪參益氣滴丸靶點(diǎn)基因和HFpEF 疾病靶點(diǎn)基因交集，共獲得芪參益氣滴丸治療HFpEF 的潛在靶點(diǎn)基因262 個(gè)，具有治療HFpEF 作用的活性成分95 個(gè)，其中靶基因數(shù)目在20 以上的主要活性成分26 個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 芪參益氣滴丸治療射血分?jǐn)?shù)保留心衰的主要活性成分

2.2 “藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)互作分析結(jié)果

利用Cytoscape 3.2.1 構(gòu)建芪參益氣滴丸治療HFpEF 的“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖共包含361 個(gè)節(jié)點(diǎn)（4 個(gè)藥物，95 個(gè)成分靶點(diǎn)，262 個(gè)基因靶點(diǎn)），1362 條邊，深綠色六邊形節(jié)點(diǎn)代表藥物，淺綠色矩形節(jié)點(diǎn)代表活性成分，黃色圓形節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1（封四）。用network analyzer 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，自由度≥10 的39 個(gè)重要靶點(diǎn)基因相互作用關(guān)系。見(jiàn)圖2。

2.3 GO 富集分析

圖2 自由度≥10 的39 個(gè)重要靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

GO 富集分析結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸治療HFpEF的生物學(xué)過(guò)程主要包括血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程、系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)控、循環(huán)系統(tǒng)的血管過(guò)程、血管口徑的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞成分主要包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；分子功能主要包括受體-配體活性、受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子活性等，涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)等。見(jiàn)圖3（封四）。

2.4 信號(hào)通路富集分析

KEGG 信號(hào)通路富集靶點(diǎn)數(shù)量前20 的信號(hào)通路涉及氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、心肌纖維化和細(xì)胞凋亡等與HFpEF 密切相關(guān)的病理生理學(xué)過(guò)程。見(jiàn)圖4（封四）。

3 討論

HFpEF 是一種復(fù)雜的臨床綜合征，其病理生理學(xué)機(jī)制尚不明確，涉及全身微血管炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、上皮功能受損、神經(jīng)激素激活和心室-動(dòng)脈耦合等多個(gè)病理環(huán)節(jié)[8-9]。HFpEF 目前尚無(wú)理想的藥物治療方法，如何早期干預(yù)HFpEF 成為臨床亟待解決的難題。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為氣虛血瘀是HFpEF 的關(guān)鍵病機(jī)，益氣活血作用的中醫(yī)藥具有較好的緩解HFpEF 患者癥狀和改善心臟舒張功能的作用，展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

芪參益氣滴丸是益氣活血的代表方藥，既往研究顯示芪參益氣滴丸具有抗炎[10]、抗心肌細(xì)胞凋亡、延緩心室重構(gòu)等作用[11-14]。本研究亦發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸中黃芪、丹參、三七的20 余種主要活性成分可通過(guò)調(diào)控多個(gè)基因發(fā)揮治療作用。如丹參的有效成分丹參新酮具有抗氧化應(yīng)激的作用，其誘導(dǎo)的核因子Nrf2 和血紅素加氧酶-1 表達(dá)與MAPK 途徑有關(guān)，通過(guò)HO-1和MAPK/Nrf2 依賴途徑保護(hù)人EA.hy926 內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化低密度脂蛋白衍生的氧化應(yīng)激損傷[15]；黃芪的有效成分刀豆氨酸是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的選擇性抑制劑[16]，具有抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用。

GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析結(jié)果顯示芪參益氣滴丸可通過(guò)調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、激素調(diào)節(jié)等多個(gè)生物過(guò)程發(fā)揮治療HFpEF 的作用，這與HFpEF 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、涉及多個(gè)病理環(huán)節(jié)的疾病特點(diǎn)相吻合[3,8]。

KEGG 富集分析結(jié)果顯示芪參益氣滴丸治療HFpEF 相關(guān)通路涉及炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等多種病理生理學(xué)過(guò)程。炎癥在HFpEF的發(fā)病中扮演著重要角色[17]，Paulus 等[18]提出HFpEF發(fā)病機(jī)制的新理論，即合并癥誘導(dǎo)全身性炎癥狀態(tài)、冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮炎癥、cGMP 含量和蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）活性降低，導(dǎo)致心肌順應(yīng)性降低、心室肥大，將對(duì)HFpEF 病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)從左心室后負(fù)荷轉(zhuǎn)移到冠狀動(dòng)脈微血管炎癥。推測(cè)芪參益氣滴丸既可作用于TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等炎癥相關(guān)途徑直接抑制炎性反應(yīng)，又能作用于MAPK 信號(hào)通路等氧化應(yīng)激途徑間接抑制炎性反應(yīng)；此外，氧供需失衡在CHF 中普遍存在，HIF-1α 在組織對(duì)缺氧的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞氧供平衡，降低炎性反應(yīng)，減輕心肌纖維化[19]。HFpEF 的發(fā)病與高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等密切相關(guān)[20-21]，上述合并癥可導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[16]，大約45%的HFpEF 患者有糖尿病[22]，芪參益氣滴丸可作用于糖尿病中的AGE-RAGE 信號(hào)通路，降低高糖環(huán)境所致的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。同時(shí)，芪參益氣滴丸通過(guò)鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路等改善心肌順應(yīng)性及僵硬度，減輕心肌重構(gòu)。cGMP-PKG信號(hào)通路是HFpEF 機(jī)制的研究熱點(diǎn)，cGMP 信號(hào)傳導(dǎo)與心肌舒張功能障礙和心室重構(gòu)有關(guān)：促炎狀態(tài)下，血漿中IL-6、TNF-α、可溶性ST2 和五聚蛋白3 升高，冠狀微血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecules，VCAMs）和E-選擇蛋白，ROS 的產(chǎn)生導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低，可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）和PKG活性降低，低PKG 活性增加了心肌細(xì)胞的靜息張力；內(nèi)皮細(xì)胞中的VCAM 和E-選擇蛋白表達(dá)遷移到單核細(xì)胞內(nèi)皮下，釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使心肌順應(yīng)性降低，舒張功能障礙[23]。此外，芪參益氣滴丸通過(guò)TNF 信號(hào)通路等抑制細(xì)胞凋亡，亦是其治療HFpEF 的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)芪參益氣滴丸治療HFpEF 的活性成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行了探索性研究，初步發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸中的主要活性成分可通過(guò)調(diào)控炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激、改善心肌順應(yīng)性和調(diào)控細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮治療HFpEF 的作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑整合調(diào)節(jié)的效應(yīng)特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入開(kāi)展芪參益氣滴丸治療HFpEF 的作用機(jī)制研究提供了新的思路和線索。