張帆，韓衛(wèi)全，龐艷，龔子龍，肖婷，夏露

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是以皮膚和內(nèi)臟組織呈彌漫性或局限性纖維化進(jìn)行性硬化的自身免疫性疾病[1]。臨床上以彌漫性或局限性皮膚增厚、內(nèi)臟(心臟、肺等)器官結(jié)構(gòu)異常、器官缺血為特征性病變[2]。但SSc早期病癥較輕，常被人們忽視而延誤治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致病情加重。據(jù)統(tǒng)計(jì)65%以上的SSc患者肺部受到牽連，50%以上患者肺部呈現(xiàn)彌漫性肺間質(zhì)病變(interstitial lung disease，ILD)，即為SSc-ILD，且ILD成為SSc致死的主要原因[3]。近年來多項(xiàng)研究表明趨化因子與免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[4]。IL-8是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的單核因子，在炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)中具有重要作用。研究表明，IL-8作為趨化因子受體1(CXCR1)、CXCR2的配體，與CXCR1、CXCR2結(jié)合后能夠特異性地趨化單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞聚集到病變部位，引起組織的損傷[5]。多項(xiàng)研究表明，IL-8與受體CXCR2結(jié)合，趨化免疫細(xì)胞，激活多種炎性因子的表達(dá)[6]。但關(guān)于IL-8、CXCR1、CXCR2在SSc-ILD中的作用及其與肺功能關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究通過檢測(cè)SSc-ILD患者IL-8、CXCR1、CXCR2水平及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平，分析IL-8、CXCR1、CXCR2與SSc-ILD發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，為及時(shí)有效地診治SSc-ILD提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年5月武漢市第五醫(yī)院風(fēng)濕免疫科治療的系統(tǒng)性硬化癥患者42例作為研究對(duì)象，均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制定的SSc診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，其中合并ILD患者25例作為SSc-ILD組，非ILD患者17例作為SSc-非ILD組。另選取同期來院體檢的健康者30例為健康對(duì)照組。SSc-ILD組男2例，女23例，年齡22～60(43.75±11.06)歲；病程6個(gè)月～11年，平均(47.18±22.19)個(gè)月。SSc-非ILD組男3例，女14例，年齡23～60(44.31±10.12)歲；病程6個(gè)月～9年，平均(40.55±23.06)個(gè)月。健康對(duì)照組男5例，女25例，年齡25～65(48.34±10.56)歲。3組研究對(duì)象性別、年齡等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者及家屬知情同意并自愿簽署同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①SSc-ILD診斷符合Fleischne學(xué)會(huì)命名委員會(huì)關(guān)于SSc-ILD的定義；②無其他慢性病史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他病因引起的肺部病變；②入選前1周服用過激素類藥物。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 肺功能檢測(cè)：3組研究對(duì)象早晨禁食，采用德國(guó)耶格公司生產(chǎn)的SpiroUSB型肺功能儀檢測(cè)肺功能，用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)，第一秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1)占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)，取測(cè)定3次的平均值。

1.3.2 外周血CXCR1、CXCR2 mRNA表達(dá)檢測(cè)： (1)樣本采集，早晨空腹采集所有受試者靜脈血5 ml，分別置于2個(gè)EP管中，一管于含肝素的無菌EP管中用Ficoll Hypaque分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，一管室溫靜置30 min，離心收集血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?2)PBMC制備，取肝素抗凝全血2 ml于10 ml離心管中，加入等體積PBS溶液稀釋，再轉(zhuǎn)入預(yù)先準(zhǔn)備的Ficoll Hypaque 4 ml，離心后上層白色即為PBMC；加入RPMI1640完全培養(yǎng)液5～10 ml，2 000 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞2次，收集沉淀細(xì)胞，并以RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞為1×106/ml；(3)取調(diào)整為1×106/ml的PBMC，依照Trizol試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)使用步驟提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度(OD)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算RNA濃度；將純度良好的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)使用說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μl，SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl。熒光定量PCR儀反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物序列，引物序列如表2(委托上海生工公司合成)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行Ct值分析[8]，計(jì)算CXCR1和CXCR2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 3組研究對(duì)象臨床資料比較

1.3.3 血清CRP、ESR、IL-8、IgA、IgG、IgM、補(bǔ)體C3水平檢測(cè)：上述血清采用ELISA方法檢測(cè)白介素-8(IL-8)，試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；采用意大利Vital Microsed-System全自動(dòng)血沉儀檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率(ESR)，免疫比濁法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)、IgA、IgG、IgM、補(bǔ)體C3水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組肺功能比較 SSc-ILD組FEV1%、FEV1/FVC低于SSc-非ILD組低于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表3。

表3 3組受試者肺功能比較

2.2 3組CXCR1、CXCR2 mRNA表達(dá)水平比較 SSc-ILD組CXCR1、CXCR2 mRNA表達(dá)水平高于SSc-非ILD組高于健康對(duì)照組(P均<0.01)，見表4。

表4 3組受試者CXCR1、CXCR2mRNA表達(dá)水平比較

2.3 3組血清IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM、C3水平比較 SSc-ILD組IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM水平顯著高于SSc-非ILD組高于健康對(duì)照組(P均<0.05)， 各組C3水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表2 RT-qPCR引物序列

表5 3組受試者血清中IL-8、ESR、CRP、IgA、IgG、IgM、C3水平比較

2.4 外周血CXCR1、CXCR2、IL-8水平與肺功能的關(guān)系 SSc-ILD患者外周血中CXCR1、CXCR2及血清IL-8水平與FEV1%呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；CXCR1、IL-8與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CXCR2與FEV1/FVC無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表6。

表6 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與肺功能的相關(guān)性

2.5 外周血CXCR1、CXCR2、IL-8水平與相關(guān)因子的相關(guān)性 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與CRP、ESR、IgA、IgG、IgM均呈正相關(guān)(P<0.05)，與C3無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表7。

表7 SSc-ILD患者CXCR1、CXCR2、IL-8與CRP、ESR、免疫球蛋白和補(bǔ)體的相關(guān)性

3 討 論

SSc是以皮膚炎性反應(yīng)、纖維化、增厚進(jìn)而硬化、萎縮為主要特征的風(fēng)濕性疾病，SSc往往引起肺臟結(jié)構(gòu)異常、肺間質(zhì)病變[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ILD是SSc預(yù)后不良的主要因素，SSc的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但SSc-ILD的發(fā)病與多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等多種因素密切相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可在機(jī)體內(nèi)釋放細(xì)胞因子并作用于CD8+T細(xì)胞，并與釋放的相關(guān)細(xì)胞因子共同參與自身免疫性疾病過程[11]。趨化因子及其受體在炎性反應(yīng)中具有重要作用，特別與炎性細(xì)胞的募集密切相關(guān)[12]。目前對(duì)于SSc-ILD的早期診斷和治療還缺乏有效的手段。為了明確SSc-ILD發(fā)病與機(jī)體免疫反應(yīng)及其趨化作用的關(guān)系，本研究主要針對(duì)外周血中CXCR1、CXCR2及血清中IL-8在SSc-ILD中的表達(dá)水平及與免疫蛋白的關(guān)系進(jìn)行分析。

趨化因子可分為4型，即CXC型、CC型、C型、CX3C型，趨化因子與其特異性的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。CXCR1和CXCR2是一條肽鏈的糖蛋白，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族成員，為趨化細(xì)胞因子的受體，其與細(xì)胞因子的活化、增殖、募集及血管形成前體物質(zhì)等有關(guān)[13]。CXCR1和CXCR2主要表達(dá)于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等細(xì)胞表面；IL-8是CXCR1和CXCR2的共同配體，可促進(jìn)CXC趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究結(jié)果顯示，SSc-ILD患者外周血單核細(xì)胞上的CXCR1、CXCR2 mRNA及血清IL-8表達(dá)水平顯著升高，表明IL-8可能通過與其受體結(jié)合發(fā)揮炎性反應(yīng)作用。CXCR1和CXCR2與IL-8結(jié)合后能夠激活G蛋白耦聯(lián)受體通路，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。研究報(bào)道，無抗原活性的突變體G31P與IL-8受體CXCR1、CXCR2結(jié)合后可抑制中性粒細(xì)胞的趨化作用，減輕炎性反應(yīng)[15]。鱗狀細(xì)胞癌患者的皮膚損傷部位中IL-8及其配體CXCR1、CXCR2異常表達(dá)[16]。臨床上常結(jié)合肺功能檢測(cè)評(píng)估ILD對(duì)肺臟的損傷程度，F(xiàn)VC對(duì)于肺間質(zhì)纖維化病變反應(yīng)敏感。本研究對(duì)患者肺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，SSc-ILD組患者FEV1%、FEV1/FVC明顯降低，表明SSc-ILD可能嚴(yán)重影響患者的肺功能。進(jìn)一步進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示IL-8、CXCR1、CXCR2與FEV1%、FEV1/FVC密切相關(guān)，表明隨著IL-8介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的增強(qiáng)，肺功能受損嚴(yán)重。研究表明，IL-8可引起外周血中性粒細(xì)胞增加，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)、溶酶體酶促進(jìn)肺部炎性反應(yīng)。

IgA是分泌型蛋白中的主要蛋白，是機(jī)體防御中的第一道防線，可介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用(ADCC)，在免疫性疾病中常升高[17]。研究發(fā)現(xiàn)在過敏性紫癜患者中IgA合成增加，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、IL-6等過度表達(dá)，造成腎損傷。IgG約占免疫球蛋白的75%，是血清免疫球蛋白的主要成分[18]。IgM是抗原刺激后機(jī)體內(nèi)最先出現(xiàn)的抗體。研究報(bào)道，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕病等免疫性疾病中IgG表達(dá)升高，可提高免疫反應(yīng)[19]。IL-8是重要的促炎細(xì)胞因子和中性粒細(xì)胞趨化因子，研究報(bào)道，在兒童肺炎支原體感染中IL-8促進(jìn)炎性反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，引起IgG、IgM水平升高[20]。本研究結(jié)果顯示，SSc-ILD組患者IgA、IgG、IgM水平顯著升高，C3水平減少，且IL-8、CXCR1、CXCR2均與IgA、IgG、IgM有關(guān)，表明SSc-ILD中IL-8引起的炎性反應(yīng)刺激機(jī)體啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答，引起自身免疫紊亂。CRP在正常機(jī)體表達(dá)較少，在機(jī)體感染和炎性反應(yīng)時(shí)濃度顯著升高，其與ESR是臨床常用的非特異性炎性指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與SSc-非ILD組和健康對(duì)照組比較，SSc-ILD組ESR、CRP水平明顯升高，相關(guān)性分析顯示，IL-8、CXCR1、CXCR2與ESR、CRP相關(guān)，表明IL-8、CXCR1、CXCR2可能參與機(jī)體非特異性炎性反應(yīng)，引起組織損傷。

綜上所述，SSc-ILD患者血清中趨化因子IL-8、CXCR1、CXCR2表達(dá)顯著升高，炎性因子IL-8表達(dá)也顯著升高，表明IL-8可能通過其受體CXCR1、CXCR2在SSc-ILD疾病中發(fā)揮作用，但其與炎性因子的作用機(jī)制，以及與肺功能指標(biāo)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張帆：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；韓衛(wèi)全：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；龐艷：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；龔子龍、肖婷：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；夏露：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫