康 愷 吳 江 苑麟勇 劉麗歡 陳永靈 效 梅 安立龍

尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離培養(yǎng)體系建立及優(yōu)化*

康 愷 吳 江 苑麟勇 劉麗歡 陳永靈 效 梅 安立龍①

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院 湛江 524088)

本研究分離培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)()精巢支持細(xì)胞(Sertoli cells, SCs)，建立并優(yōu)化尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離培養(yǎng)體系。無(wú)菌條件下，取發(fā)育至第Ⅲ期的尼羅羅非魚(yú)精巢，PBS清洗后，剪碎精巢組織，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%犢牛血清(Newborn bovine serum, NBS)的L-15培養(yǎng)液終止消化，過(guò)濾、離心，獲得細(xì)胞。差速貼壁法獲得SCs后，在26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別采用含10% NBS的L-15、M199、F12培養(yǎng)液，含5%、10%、15% NBS的L-15培養(yǎng)液，含1%羅非魚(yú)血清的L-15+10% NBS培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)SCs。各組每2 d取細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制SCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)；甲基綠染色，倒置顯微鏡下觀察SCs的形態(tài)。尼羅羅非魚(yú)SCs培養(yǎng)1~2 d，細(xì)胞貼壁；培養(yǎng)3~5 d，細(xì)胞完全貼壁并迅速增殖。單個(gè)SCs呈不規(guī)則多邊形，其核位于胞質(zhì)中央，呈卵圓形，胞質(zhì)中可見(jiàn)吞噬顆粒和空泡，空泡聚集于支持細(xì)胞胞質(zhì)的兩極或散布于核的四周。SCs在L-15培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)，在F12、M199培養(yǎng)基中較難貼壁。與F12、M199培養(yǎng)液相比，L-15培養(yǎng)液更有助于尼羅羅非魚(yú)SCs生長(zhǎng)增殖(<0.01)。與添加5%和15% NBS相比，在L-15培養(yǎng)基中添加10% NBS更有助于尼羅羅非魚(yú)SCs生長(zhǎng)增殖(<0.05)。與未添加尼羅羅非魚(yú)血清相比，在10% NBS+L-15培養(yǎng)中添加1%尼羅羅非魚(yú)血清，能顯著促進(jìn)SCs生長(zhǎng)增殖(<0.05)。研究表明，采用胰酶消化差速貼壁法獲得尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞，10% NBS+1%羅非魚(yú)血清+L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，能顯著促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

尼羅羅非魚(yú)；支持細(xì)胞；分離培養(yǎng)；體系優(yōu)化

支持細(xì)胞作為睪丸中的一種重要組成細(xì)胞，在研究有關(guān)雄性生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制以及外源性物質(zhì)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的作用機(jī)理時(shí)，不可避免地要涉及到支持細(xì)胞(Edelsztein, 2018)。近年來(lái)對(duì)支持細(xì)胞的研究表明，支持細(xì)胞合成分泌SCF、FGF、TGF和IGF等生長(zhǎng)因子(Jiang, 2013)，對(duì)精原干細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，支持細(xì)胞與原始生殖細(xì)胞、精原干細(xì)胞等聯(lián)合培養(yǎng)，可促進(jìn)共培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖(Regueira, 2014)。

支持細(xì)胞具有免疫抑制功能，可以用于在睪丸以外的部位為移植細(xì)胞提供免疫豁免的環(huán)境(Koji, 2001; Luca, 2018)。Willing等(1999)將睪丸支持細(xì)胞和胚胎中腦細(xì)胞共同培養(yǎng)后移植入帕金森病動(dòng)物模型腦中，7 d后移植部位酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，而且神經(jīng)元胞體的大小和突起均有增加。而這些都要以支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)為基礎(chǔ)，有關(guān)支持細(xì)胞的體外分離、純化及培養(yǎng)的研究，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道(滕琰等, 2005; Sakai, 2002)，分離純度達(dá)到90%，并建立了一些支持細(xì)胞株，但大多都集中在哺乳動(dòng)物，對(duì)魚(yú)類(lèi)支持細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究極少(Ghaem Maghami, 2018)。

尼羅羅非魚(yú)()屬于鱸形目麗魚(yú)科，原產(chǎn)于坦噶尼喀湖，是羅非魚(yú)中最大型的品種(黨廣成等, 2011; 趙麗慧等, 2014)。本研究以尼羅羅非魚(yú)為對(duì)象，研究尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離、純化和體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性，建立并優(yōu)化尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，以期為魚(yú)類(lèi)支持細(xì)胞體外培養(yǎng)建系提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性尼羅羅非魚(yú)購(gòu)自湛江國(guó)聯(lián)水產(chǎn)開(kāi)發(fā)股份有限公司吳川基地，自然生長(zhǎng)且無(wú)生殖系統(tǒng)疾病，體長(zhǎng)為(9.5±0.5) cm、精巢發(fā)育至第Ⅲ期。飼養(yǎng)于1.2 m×1.0 m的孵化桶，每隔3 d換水1次，每天早晚各飼喂 1次。實(shí)驗(yàn)前，將羅非魚(yú)在0.1%高錳酸鉀中浸泡30 min。

1.2 支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.2.1 胰蛋白酶消化法 無(wú)菌條件下取羅非魚(yú)兩側(cè)精巢，放入含有雙抗的PBS中漂洗5~10 min，除去粘膜及雜質(zhì)，最后用L-15培養(yǎng)液(Gibco)洗1遍。用手術(shù)剪將其剪成1 mm3左右的小塊，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，除去大部分游離的精子細(xì)胞和其他細(xì)胞，用含有雙抗的PBS清洗濾網(wǎng)上的組織塊2次后，收集精巢組織塊，加入4 ml 0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA的消化液，26℃消化5~10 min，倒置顯微鏡(OLYMPUS IX53)下見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞游離分散，立即加4 ml含10%犢牛血清(NBS, 四季青生物工程材料有限公司)的培養(yǎng)液終止消化，用移液槍吹打，使細(xì)胞盡量游離。用200目濾網(wǎng)過(guò)濾未完全消化的組織塊，過(guò)濾細(xì)胞懸液經(jīng)1000 r/min離心5 min，去除上清液，加入新鮮培養(yǎng)液重懸。取少許細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，測(cè)定死細(xì)胞比率。

采用差速貼壁法(利用支持細(xì)胞可以牢固貼壁生長(zhǎng)，而體外培養(yǎng)的生殖細(xì)胞往往貼壁能力弱，需要貼附于飼養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn))將支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞分離純化，即將上步獲得細(xì)胞懸液調(diào)整到1×106個(gè)/ml后，種植到鋪有明膠的培養(yǎng)瓶，置于26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱(上海迅博)中培養(yǎng)24 h。然后，用移液槍輕輕吹洗貼壁細(xì)胞，使未貼壁的生殖細(xì)胞浮起，棄去培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，每3天換液1次。

1.2.2 組織塊貼壁法 無(wú)菌條件下取羅非魚(yú)兩側(cè)精巢，放入含有雙抗的PBS中漂洗5~10 min，除去粘膜及雜質(zhì)，最后用培養(yǎng)液L-15清洗1遍。用手術(shù)剪將其剪成1 mm3左右的小塊，組織塊間以5 mm間距均勻擺放入培養(yǎng)瓶中，置于26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過(guò)12 h后加入新鮮培養(yǎng)液，置于26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后換液，之后，每3 d換液1次。待細(xì)胞連接成片后，移去組織塊。

1.3 支持細(xì)胞的繼代培養(yǎng)

支持細(xì)胞1~5代傳代采用原瓶傳代，待貼壁細(xì)胞密度達(dá)70%以上時(shí)進(jìn)行傳代。用PBS清洗1~2次后，加消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA) 2 ml，消化2~5 min，培養(yǎng)基終止消化并吹打懸浮貼壁細(xì)胞。細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，去除上清液，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，接種到新的培養(yǎng)瓶中，置于26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液，除去死細(xì)胞，此后，每24 h觀察，每3 d換液2/3，長(zhǎng)滿(mǎn)單層后可繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4 支持細(xì)胞生長(zhǎng)特性觀察和鑒定

對(duì)貼壁的單層細(xì)胞用堿性磷酸酶(AKP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)染色，檢測(cè)支持細(xì)胞純度，觀察有無(wú)混在其中的精原干細(xì)胞，然后甲基綠復(fù)染檢測(cè)支持細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及染色情況。

1.5 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

用0.25%胰蛋白酶消化生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2~5代尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞，分裝在3支不同的離心管中，1000 r/min離心5 min，除去上清液，分別使用L-15、F12(Gibco)、M199培養(yǎng)液(Gibco)重懸細(xì)胞(在此基礎(chǔ)上添加10% NBS+1 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素、15 mmol/L HEPES，均購(gòu)置于碧云天生物公司)，取少許臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 血清對(duì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

方法同1.5?；A(chǔ)培養(yǎng)液：L-15+1 mmol/L丙酮酸鈉+2 mmol/L谷氨酰胺+100 IU/ml青霉素+100 IU/ml鏈霉素+15 mmol/L HEPES。在此基礎(chǔ)上，分別添加5%、10%和15%的NBS；探討不同濃度NBS對(duì)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10% NBS的基礎(chǔ)上添加1%羅非魚(yú)血清，研究羅非魚(yú)血清對(duì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。

1.7 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。調(diào)整細(xì)胞懸液密度約為105個(gè)/ml，少許臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞存活率。將其余細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d取出3孔細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞存活率。共觀察12 d，每3 d換液1次。以細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)采用隨機(jī)分組設(shè)計(jì)原理，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組間采用LSD法進(jìn)行多重比較，以<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)。

2 結(jié)果

2.1 胰蛋白酶消化法與組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

2.1.1 胰蛋白酶消化法分離、培養(yǎng)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)特性

用0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化分離，得到尼羅羅非魚(yú)精巢細(xì)胞，在26℃、無(wú)CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后，支持細(xì)胞貼壁并極化，胞體多呈長(zhǎng)柱狀，兩側(cè)大多有突起，折光性較強(qiáng)，數(shù)量約占90%。培養(yǎng)3 d后，成簇的支持細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)，支持細(xì)胞胞體增大，呈膜狀鋪在培養(yǎng)瓶壁上，形成細(xì)胞單層(圖1A)。培養(yǎng)10 d后，細(xì)胞增殖速度減慢，70%~80%細(xì)胞融合形成非常牢固的細(xì)胞間連接，胞核清晰可見(jiàn)(圖1B)。

圖1 支持細(xì)胞的胰蛋白酶分離、純化后的培養(yǎng)結(jié)果

A：體外培養(yǎng)3 d的原代細(xì)胞；B：體外培養(yǎng)10 d的原代細(xì)胞

A: Primary cells cultured for 3 days; B: Primary cells cultured for 10 days

2.1.2 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)精巢組織細(xì)胞的結(jié)果 采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)第2天時(shí)，可見(jiàn)從組織塊周?chē)坞x出少量細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)不一，有呈圓形的細(xì)胞；有呈梭形的細(xì)胞，為成纖維細(xì)胞；支持細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形的，胞體較大，胞體內(nèi)可見(jiàn)吞噬的小顆粒狀物質(zhì)。第3天開(kāi)始，游離出的細(xì)胞生長(zhǎng)增快，組織塊周?chē)芍旅艿募?xì)胞層(圖2A)。培養(yǎng)第7天，部分組織塊脫離培養(yǎng)瓶壁，游離出的細(xì)胞已成簇生長(zhǎng)。取出組織塊后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，成簇生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸連接成片，形成細(xì)胞單層。但混雜許多成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞層上粘附有大量的生殖細(xì)胞(圖2B)。

2.2 支持細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及鑒定

支持細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)時(shí)呈長(zhǎng)柱狀或三角形，當(dāng)單獨(dú)存在的支持細(xì)胞伸展鋪開(kāi)后，其胞質(zhì)鋪展得很大，呈不規(guī)則的多邊形，可見(jiàn)胞質(zhì)中吞噬的小顆粒狀物質(zhì)和空泡。體外培養(yǎng)支持細(xì)胞，細(xì)胞的突起相互連接，呈單層膜狀。AKP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞不著色，為AKP陰性(圖3A)；甲基綠染色顯示，胞質(zhì)中可見(jiàn)多量大小不一的未染色空泡狀結(jié)構(gòu)。這些空泡狀的結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)小滴，大小不一，呈圓形或卵圓形，懸浮狀存在，聚集于支持細(xì)胞胞質(zhì)的兩極或散布于核的四周(圖3B)。

圖2 支持細(xì)胞的組織塊培養(yǎng)

A：體外培養(yǎng)3 d的原代細(xì)胞；B：體外培養(yǎng)7 d的原代細(xì)胞

A: Primary cells cultured for 3 days; B: Primary cells cultured for 7 days

圖3 支持細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

A：AKP染色后的支持細(xì)胞；B：甲基綠染色后的支持細(xì)胞

A: Sertoli cells after AKP staining; B: Sertoli cells after methyl green dyeing

2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)支持細(xì)胞體外增殖的影響

用含10% NBS的L-15、F12和M199基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在26℃、無(wú)CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞。用F12和M199培養(yǎng)的支持細(xì)胞不易貼壁，細(xì)胞未能鋪滿(mǎn)50%皿底已停止生長(zhǎng)，而用L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)的支持細(xì)胞貼壁良好，活力較強(qiáng)，生長(zhǎng)旺盛。培養(yǎng)4 d后細(xì)胞保持較快增殖速度，8~10 d即可形成細(xì)胞單層。第8天后，F(xiàn)12和M199培養(yǎng)液中的支持細(xì)胞停止生長(zhǎng)，逐漸老化脫落，隨換液而丟失。培養(yǎng)第10天后，F(xiàn)12和M199培養(yǎng)液中已貼壁的支持細(xì)胞逐漸回縮，開(kāi)始大量脫落；L-15中的細(xì)胞此時(shí)已連接成片，但細(xì)胞生長(zhǎng)增殖開(kāi)始變慢。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)支持細(xì)胞在L-15、F12和M199培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)增殖情況，支持細(xì)胞在3種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。

圖4 羅非魚(yú)支持細(xì)胞在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

同一時(shí)間標(biāo)注不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(<0.01)，相同字母表示差異不顯著(>0.05)。生物學(xué)重復(fù)=3，下同

Different letters marked on the data at the same time mean the difference was highly significant (<0.01), the same letters mean no significant difference (>0.05). Biological repeats=3, the same as below

如圖4所示，L-15培養(yǎng)液中的細(xì)胞增殖明顯快于F12和M199組(<0.01)。L-15組中，第4天后支持細(xì)胞的數(shù)量明顯多于F12和M199組(<0.01)，結(jié)果表明，L-15培養(yǎng)基更有助于尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

2.4 犢牛血清對(duì)支持細(xì)胞體外增殖的影響

以L-15為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其中分別添加5%、10%和15% NBS，培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組貼壁都較好，5% NBS形成的細(xì)胞單層面積略小，培養(yǎng)5 d后，5% NBS組細(xì)胞增殖相對(duì)變慢，可見(jiàn)許多單個(gè)支持細(xì)胞胞體增大，呈膜狀鋪在培養(yǎng)瓶壁上。而10%和15% NBS組，細(xì)胞生長(zhǎng)致密，細(xì)胞之間的連接非常牢固。培養(yǎng)5 d后，10%和15% NBS組中一些細(xì)胞集落成簇生長(zhǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖狀況，生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 添加不同濃度犢牛血清時(shí)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

如圖5所示，15% NBS組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖顯著快于5% NBS組(<0.05)；10% NBS組細(xì)胞增殖極顯著快于5% NBS組(<0.01)。在培養(yǎng)第8天時(shí)，15% NBS組中的細(xì)胞數(shù)量顯著多于5% NBS組(<0.05)；在第6天、第10天和第12天，15% NBS組中的細(xì)胞數(shù)量極顯著多于5% NBS組(<0.01)；培養(yǎng)第6~12天時(shí)，10% NBS組細(xì)胞數(shù)量極顯著多于5% NBS組(<0.01)；培養(yǎng)第8天時(shí)，10% NBS組中的細(xì)胞數(shù)量顯著多于15% NBS組(<0.05)；培養(yǎng)第10天時(shí)，10% NBS組中的細(xì)胞數(shù)量極顯著多于15% NBS組(<0.01)。結(jié)果表明，添加10% NBS更有利于支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。

2.5 羅非魚(yú)血清對(duì)支持細(xì)胞的影響

以L-15+10% NBS為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加1%的羅非魚(yú)血清，培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)前8天，與對(duì)照組相比，支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯差別，支持細(xì)胞貼壁良好、成簇生長(zhǎng)。第8天后，添加羅非魚(yú)血清組，支持細(xì)胞連接緊密，形成的細(xì)胞單層面積比對(duì)照組明顯增大。在培養(yǎng)第10天，1%羅非魚(yú)血清組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組(<0.05)；在第8天和第12天時(shí)，添加1%羅非魚(yú)血清組細(xì)胞數(shù)量極顯著多于對(duì)照組(<0.01)。結(jié)果表明，添加1%羅非魚(yú)血清更有助于支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖狀況，生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖6。

圖6 添加羅非魚(yú)血清時(shí)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

同一時(shí)間標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(<0.01)，生物學(xué)重復(fù)=3

The different lowercase letters marked on the data at the same time mean difference was significant (<0.05), different capital letters mean difference was highly significant (<0.01). Biological repeats=3

3 討論

3.1 支持細(xì)胞的分離與純化方法

羅非魚(yú)的精巢為小葉型，由結(jié)締組織分隔形成小葉，每個(gè)小葉周邊由支持細(xì)胞與分隔的結(jié)締組織構(gòu)成，支持細(xì)胞從小葉間獲得營(yíng)養(yǎng)供小葉內(nèi)生殖細(xì)胞生長(zhǎng)分化，保證精子發(fā)育。選用發(fā)育到Ⅲ期的羅非魚(yú)精巢以期分離原代支持細(xì)胞，其精巢中主要為生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞、精子以及少量的成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞。原代細(xì)胞分離純化的方法常用胰蛋白酶消化法和組織塊法。本研究中，胰蛋白酶消化法分離、培養(yǎng)得到的支持細(xì)胞純度較高，基本沒(méi)有混雜的生殖細(xì)胞，而組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)精巢組織時(shí)，組織塊中游離出大量的生殖細(xì)胞，粘附在組織塊周?chē)募?xì)胞層上，雜細(xì)胞較多，不利于支持細(xì)胞的純化。已報(bào)道的哺乳動(dòng)物支持細(xì)胞分離純化的文獻(xiàn)，也大多采用胰酶消化法和差速貼壁的方法來(lái)獲得高純度的支持細(xì)胞。采克俊等(2008)在分離雞睪丸支持細(xì)胞時(shí)，首先用10倍于組織塊體積的1 mg/ml膠原酶消化，在37℃作用30 min, 期間每隔5 min混勻1次，之后用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化5 min，300目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾，差速貼壁法去除大部分生殖細(xì)胞，支持細(xì)胞得到純化。Syed等(2001)采用20 mmol/L Tris-HCl對(duì)培養(yǎng)中的支持細(xì)胞進(jìn)行低滲處理，可有效去除生殖細(xì)胞，而不會(huì)影響支持細(xì)胞的生長(zhǎng)。采克俊等(2008)發(fā)現(xiàn)，雞睪丸支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞貼壁都較快，貼壁的時(shí)間差較小，要經(jīng)低滲處理去除生殖細(xì)胞，才能獲得較純的支持細(xì)胞。

本研究所用方法與已報(bào)道的動(dòng)物支持細(xì)胞分離、純化方法有所不同。在本研究中，并未進(jìn)行低滲處理，直接使用0.25%胰蛋白酶消化尼羅羅非魚(yú)精巢組織，分離的細(xì)胞可以達(dá)到90%的存活率。將分離得到的細(xì)胞接種后，用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞的游離期一般為12~24 h，24 h后部分支持細(xì)胞貼壁，胞質(zhì)開(kāi)始鋪展、伸出突起。本研究在純化支持細(xì)胞的過(guò)程中，當(dāng)支持細(xì)胞貼壁有小部分胞質(zhì)開(kāi)始鋪展、少量支持細(xì)胞伸出突起時(shí)，即用移液槍吸取培養(yǎng)液輕輕吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，然后吸去瓶?jī)?nèi)含有生殖細(xì)胞的培養(yǎng)液，PBS清洗2遍后，換新鮮培養(yǎng)液，基本上無(wú)生殖細(xì)胞，從而使支持細(xì)胞得到純化。本研究并未進(jìn)行低滲處理，而是通過(guò)縮短貼壁時(shí)間和吹洗支持細(xì)胞的方法，這樣操作雖然會(huì)使獲得的支持細(xì)胞總數(shù)減少，但會(huì)降低低滲方法對(duì)細(xì)胞造成的傷害，并且同樣保證了支持細(xì)胞的純度。結(jié)果顯示，這種方法對(duì)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞的純化簡(jiǎn)單有效，獲得了90%純度的支持細(xì)胞。

3.2 支持細(xì)胞的鑒定

支持細(xì)胞的鑒定，一般有細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞染色鑒定等方法(Ghaem Maghami, 2018; 胡曉鵬等, 2015; 于磊等, 2013)。支持細(xì)胞體外培養(yǎng)特性表現(xiàn)為貼壁生長(zhǎng)的多邊形上皮樣細(xì)胞，本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)也主要是貼壁的多角形上皮樣細(xì)胞，與已報(bào)道的其他物種的支持細(xì)胞形態(tài)一致。張學(xué)明等(2001)采用油紅O染色法，鏡檢發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞兩極有許多被染成紅色或紅褐色大小不一的圓形小泡，結(jié)果證實(shí)為HE染色中所觀察到的空泡，其實(shí)質(zhì)是支持細(xì)胞胞質(zhì)中的微小脂滴。本研究中，培養(yǎng)細(xì)胞甲基綠染色后，可以明顯看到支持細(xì)胞的細(xì)胞核著色，而許多胞質(zhì)中未染色的空泡樣結(jié)構(gòu)，為支持細(xì)胞胞質(zhì)中的脂滴。本研究根據(jù)前人對(duì)支持細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的研究報(bào)道，結(jié)合細(xì)胞染色，觀察了尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞的一般形態(tài)特征，對(duì)其作了初步鑒定。差速貼壁法分離純化的貼壁支持細(xì)胞純度較高，但其中依然會(huì)有生殖細(xì)胞混雜，而AKP活性染色是檢測(cè)生殖細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)。利用AKP染色可以檢測(cè)在培養(yǎng)的支持細(xì)胞中有無(wú)生殖細(xì)胞混雜。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)胞不著色，為AKP陰性，只有少數(shù)不規(guī)則組織樣的細(xì)胞團(tuán)被染上黑色，為AKP陽(yáng)性，未見(jiàn)生殖細(xì)胞，表明本研究所使用的純化方法效果較好；而根據(jù)國(guó)內(nèi)外的AKP鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，管周細(xì)胞能被AKP染色標(biāo)記上，為AKP陽(yáng)性，支持細(xì)胞不能被標(biāo)記，為AKP陰性(Chapin, 1987)，證明本研究采用的分離、純化支持細(xì)胞的方法是有效的，獲得了高純度的支持細(xì)胞。

3.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)液有MEM、DMEM、F-12、M199和L-15等(Sakai, 2002; 上官芳芳等, 2003)。周元陵等(2005)培養(yǎng)睪丸支持細(xì)胞采用的培養(yǎng)液是DMEM/F-12，其中添加維生素A和維生素E、胰島素、卵泡刺激素、睪酮和抗生素等。Matsui等(1991)用高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)支持細(xì)胞，取得較為理想的結(jié)果。在以上的研究中，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是生長(zhǎng)在5% CO2的環(huán)境中。而魚(yú)類(lèi)體外細(xì)胞培養(yǎng)有些是在5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，也有在大氣環(huán)境中培養(yǎng)。因此，對(duì)于不同動(dòng)物的不同細(xì)胞，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)環(huán)境和需要，選擇不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

HEPES作為緩沖劑可用來(lái)代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。本研究采用HEPES作為緩沖劑，保持培養(yǎng)液pH值穩(wěn)定在7.0~7.2范圍內(nèi)，在大氣環(huán)境中培養(yǎng)支持細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使用HEPES作為緩沖劑，M199與F12培養(yǎng)液pH值變化也較大，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液pH值顯著升高，而支持細(xì)胞在pH值較高的環(huán)境下，貼壁困難，不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。Leiboviz′s L-15培養(yǎng)液可用來(lái)在大氣環(huán)境中使神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎(chǔ)，含有高濃度的氨基酸來(lái)提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)液中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。L-15培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)明顯，特別是在保持較高CO2濃度時(shí)，因此在大氣環(huán)境下培養(yǎng)支持細(xì)胞，L-15有其不可替代的優(yōu)點(diǎn)。Sakai(2002)用L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液在大氣環(huán)境中成功培養(yǎng)了斑馬魚(yú)()精原干細(xì)胞及支持細(xì)胞。本研究表明，與F12和M199相比，用L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞，細(xì)胞貼壁良好，生長(zhǎng)迅速，更有助于尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，證實(shí)在大氣環(huán)境中，L-15培養(yǎng)液較適合培養(yǎng)支持細(xì)胞。

3.4 血清對(duì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

支持細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究中，常添加10%~15%的胎牛血清或10%~15%犢牛血清(NBS)作為對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的補(bǔ)充。在本研究中，分別用添加5%、10%和15% NBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞，探討了NBS對(duì)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。并在添加10% NBS基礎(chǔ)上再添加1%羅非魚(yú)血清，探討了羅非魚(yú)血清對(duì)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15% NBS使支持細(xì)胞不易貼壁，但貼壁的細(xì)胞生長(zhǎng)特性無(wú)明顯變化；與添加5%和15% NBS相比，10% NBS極顯著促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)支持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響(<0.01)。與對(duì)照組相比，在添加10% NBS基礎(chǔ)上再添加1%羅非魚(yú)血清能顯著促進(jìn)支持細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖(<0.05)。

Cai KJ, Liu L, Ding HL,. Isolation, purification and characterization of sertoli cells from embryonic chickens. Chinese Journal of Cell Biology, 2008, 30(6): 791–797 [采克俊, 劉莉, 丁海雷, 等. 雞胚睪丸支持細(xì)胞的分離、純化與鑒定. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008, 30(6): 791–797]

Chapin RE, Phelps JL, Miller BE,. Alkaline phosphatase histochemistry discriminates peritubular cells in primary rat testicular cell culture. Journal of Andrology, 1987, 8(3): 155–161

Dang GC, Liu YQ, Fu PS,. Effect of high temperature treatment on sex differentiation and growth in Nile tilapia. Progress in Fishery Sciences, 2011, 32(5): 32–37 [黨廣成, 劉羽清, 付佩勝, 等. 高溫誘導(dǎo)對(duì)尼羅羅非魚(yú)性別分化及生長(zhǎng)的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(5): 32–37]

Edelsztein NY, Racine C, di Clemente N,. Androgens downregulate anti-Müllerian hormone promoter activity in the Sertoli cell through the androgen receptor and intact steroidogenic factor 1 sites. Biology of Reproduction, 2018, 99(6): 1303–1312

Ghaem Maghami R, Mirzapour T, Bayrami A. Differentiation of mesenchymal stem cells to germ-like cells under induction of Sertoli cell-conditioned medium and retinoic acid. Andrologia, 2018, 50(3): e12887

Hu XP, Yang F, Lv ZX,. Investigations on the expression of protein markers in Sertoli cells. Reproduction and Contraception, 2015, 35(8): 509–516, 524 [胡曉鵬, 楊凡, 呂忠顯. 小鼠睪丸支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的研究. 生殖與避孕, 2015, 35(8): 509–516, 524]

Jiang J, Zhang N, Shiba H,. Spermatogenesis associated 4 promotes Sertoli cell proliferation modulated negatively by regulatory factor X1. PLoS One, 2013, 8(10): e75933

Koji T, Hishikawa Y, Ando H,. Expression of Fas and Fas ligand in normal and ischemia-reperfusion testes: Involvement of the Fas system in the induction of germ cell apoptosis in the damaged mouse testis. Biology of Reproduction, 2001, 64(3): 946–954

Luca G, Baroni T, Arato I,. Role of Sertoli cell proteins in immunomodulation. Protein and Peptide Letters, 2018, 25(5): 440–445

Matsui Y, Toksoz D, Nishikawa S,. Effect of steel factor and leukaemia inhibitory factor on murine primordial germ cells in culture. Nature, 1991, 353(6346): 750–752

Regueira M, Riera MF, Galardo MN,. Activation of PPAR α and PPAR β/δ regulates Sertoli cell metabolism. Molecular and Cellular Endocrinology, 2014, 382(1): 271–281

Sakai N. Transmeiotic differentiation of zebrafish germ cells into functional sperm in culture. Development, 2002, 129(14): 3359–3365

Shangguan FF, Shi XL. The promotive effect of Sertoli cell on neurons. Acta Anatomica Sinica, 2003, 34(5): 510–513 [上官芳芳, 史小林. 睪丸支持細(xì)胞促進(jìn)體外培養(yǎng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的研究. 解剖學(xué)報(bào), 2003, 34(5): 510–513]

Syed V, Hecht NB. Selective loss of Sertoli cell and germ cell function leads to a disruption in Sertoli cell-germ cell communication during aging in the brown Norway rat. Biology of Reproduction, 2001, 64(1): 107–112

Teng Y, Xue WJ, Feng XS,. The isolation and culture of Sertoli cells from adult testis and their immune privilege mechanism. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology, 2005, 21(5): 643– 645, 649 [滕琰, 薛武軍, 馮新順, 等. 成人睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其免疫豁免機(jī)制. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2005, 21(5): 643–645, 649]

Willing AE, Othberg AI, Saporta S,. Sertoli cells enhance the survival of co-transplanted dopamine neurons. Brain Research, 1999, 822(1–2): 246–250

Yu L, Zheng P, Rong EG,. Culture and identification of testis Sertoli cells in calf. Journal of Jilin Agricultural University, 2013, 35(1): 63–66 [于磊, 鄭鵬, 榮恩光, 等. 新生牛睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定分析. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(1): 63–66]

Zhang XM, Li ZY, Lai LX,. Effects of several factors on mouse spermatogonial stem cells cultured. Chinese Journal of Veterinary Science, 2001, 21(5): 497–500 [張學(xué)明, 李子義, 賴(lài)良學(xué), 等. 幾種因素對(duì)培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞的影響. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2001, 21(5): 497–500]

Zhao LH, Jia JH, Zhang YH,. The tolerance and growth of three strains ofin salinity-alkalinity water. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(5): 26–32 [趙麗慧, 筴金華, 張艷紅, 等. 3種品系尼羅羅非魚(yú)()鹽堿耐受性和生長(zhǎng)比較. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2014, 35(5): 26–32]

Zhou YL, Zhong XJ, Wu X,. Establishment of dual-chamber model for rat Setoli cells primary culture. Journal of Environmental and Occupational Medicine, 2005, 22(3): 208– 211 [周元陵, 鐘先玖, 吳鑫, 等. 原代睪丸支持細(xì)胞分離純化及雙室培養(yǎng)模型的建立. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2005, 22(3): 208–211]

Establishment and Optimization of an Isolation and Culture System for Sertoli Cells of Nile Tilapia

KANG Kai, WU Jiang, YUAN Linyong, LIU Lihuan, CHEN Yongling, XIAO Mei, AN Lilong①

(Agricultural College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088)

The aim of this study to establish and optimize an isolation and culture system for Sertoli cells of Nile tilapia. Fresh testis tissues from Nile tilapia in development stage Ⅲ were obtained and then rinsed with phosphate-buffered saline. The tissue was dissected into segments and digested with 0.5 mg/ml collagen for 30 min, followed by 0.25% trypsin–0.04% EDTA for 5 min, and the digestion was terminated with L-15 culture medium with 10% newborn bovine serum (NBS). Sertoli cells were selected using the characteristic that they adhered more quickly than germ cells to the culture vessels. Sertoli cells were cultured in 96-well plates in L-15, M199, or F12 culture medium, supplemented with 10% NBS, or L-15 culture medium supplemented with 5%, 10%, and 15% NBS, or L-15 culture medium supplemented with 10% NBS and 1% Nile tilapia serum. For each treatment group, Sertoli cells were collected from six culture wells every 2 days; the number of cells in each well was counted using a hemocytometer, and a growth curve was drawn for the Sertoli cells. Compared with F12 or M199 culture medium, more rapid growth of Sertoli cells occurred in the L-15 culture medium (<0.01). Compared with supplementation with 5% or 15% NBS, the proliferation of Sertoli cells was accelerated (<0.05) by supplementation with 10% NBS in the culture medium. Comparatively, the effect of the addition of 1% Nile tilapia serum was greater (<0.05) than the absence of serum. The proliferation of Nile tilapia Sertoli cells can be improved by supplementation with 10% NBS and 1% Nile tilapia serum in L-15 cell culture medium.

Nile tilapia; Sertoli cell; Isolated culture; System optimization

S917.4

A

2095-9869(2020)01-0119-08

10.19663/j.issn2095-9869.20181120002

* 廣東海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金(R17027; R17021)和廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(CXXL2016012; qhjh2017zr12)共同資助 [This work was supported by Dr. Start-Up Fund of Guangdong Ocean University (R17027; R17021), and College Students′ Innovative Experimental Project of Guangdong Ocean University (CXXL2016012; qhjh2017zr12)]. 康 愷，E-mail: kangkai610@126.com

安立龍，教授，E-mail: anlilong@126.com

2018-11-20,

2018-12-24

http://www.yykxjz.cn/

康愷, 吳江, 苑麟勇, 劉麗歡, 陳永靈, 效梅, 安立龍. 尼羅羅非魚(yú)精巢支持細(xì)胞分離培養(yǎng)體系建立及優(yōu)化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(1): 119–126

Kang K, Wu J, Yuan LY, Liu LH, Chen YL, Xiao M, An LL. Establishment and optimization of an isolation and culture system for Sertoli cells of Nile tilapia. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 119–126

AN Lilong, E-mail: anlilong@126.com

(編輯 馬璀艷)