張紀(jì)亮，王力軍，謝嘉，洪美玲，丁利，李二超，刁曉平,*

1. 海南師范大學(xué)熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，?？?571158 2. 海南大學(xué)海洋學(xué)院，海口 570228

大數(shù)據(jù)時代的來臨對實驗科學(xué)，包括毒理學(xué)，產(chǎn)生了重大影響。通過對海量數(shù)據(jù)的研究分析來探索其中的規(guī)律，可以直接提出假設(shè)，并有可能為得出可靠的結(jié)論提供重要參考依據(jù)。自2004年發(fā)布以來，比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(CTD)(http://ctdbase.org)已經(jīng)發(fā)展成為一種重要的毒理信息學(xué)資源[1]。CTD數(shù)據(jù)庫通過將文獻(xiàn)資料中的信息(如文本、表格、數(shù)字和補充文件等)轉(zhuǎn)換成為帶注釋的信息，將不同的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并組織成結(jié)構(gòu)化的格式，使其具有內(nèi)聚性、可管理性和可計算性。CTD核心內(nèi)容來自3個綜合模塊：毒理基因組模塊(包含超過170萬個化學(xué)物質(zhì)-基因/蛋白質(zhì)相互作用的信息)、疾病模塊(包含超過245 000個化學(xué)物質(zhì)-疾病和基因-疾病相互聯(lián)系的信息)、暴露模塊(包含超過111 000個與環(huán)境脅迫、受體、生物標(biāo)志物和有害結(jié)局等相關(guān)的描述)[1]。在CTD數(shù)據(jù)庫中，由于詞匯表、基因符號、基因注釋和疾病等信息的標(biāo)識化，使得這些信息可以被交叉整合，從而獲得新的發(fā)現(xiàn)。因此，通過對CTD數(shù)據(jù)的手動策劃，有可能發(fā)現(xiàn)新的和全面的環(huán)境污染物暴露的毒性效應(yīng)和分子機制。

尼泊金酯(parabens)，又稱對羥基苯甲酸酯，被廣泛用于藥物和食品保存的抗微生物劑[2]。在這些化合物中，常用的包括尼泊金甲酯(methyl paraben, MeP)、尼泊金乙酯(ethyl paraben, EtP)、尼泊金丙酯(propyl paraben, PrP)、尼泊金丁酯(butyl paraben, BuP)和尼泊金芐酯(benzyl paraben, BzP)。尼泊金酯化合物作為防腐劑，已應(yīng)用于超過22 000種化妝品中，單一化合物濃度高達(dá)0.4%，而多化合物混合濃度高達(dá)0.8%[3]。尼泊金酯化合物已經(jīng)在食品中使用了幾十年，濃度高達(dá)0.1%，并且包括MeP、PrP和BuP在內(nèi)的幾種尼泊金酯化合物作為調(diào)味劑和佐劑直接添加到食品中[4]。Liao等[5]對我國各類食品中尼泊金酯化合物進(jìn)行檢測，檢出率高達(dá)99%，尼泊金酯總濃度最高達(dá)2 530 ng·g-1，尼泊金酯在各類食品中的總平均濃度為39.3 ng·g-1，其中，MeP、EtP和PrP是食品中最主要的尼泊金酯，分別占總濃度的59%、24%和10%。大量研究表明，尼泊金酯類化合物廣泛存在于人體尿液、血清、胎盤、乳腺腫瘤組織和脂肪組織中[6-8]。目前，尼泊金酯化合物在地表水中廣泛存在，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的水平最高分別可達(dá)27 500、30 500、52 100、19 900和31.0 ng·L-1[9]。我國黃河表層水中尼泊金酯總濃度為3.31～55.2 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均濃度分別為8.84、0.359、5.44、0.233和0.080 ng·L-1；淮河表層水中尼泊金酯總濃度為15.0～164 ng·L-1，其中，MeP、EtP、PrP、BuP和BzP的平均濃度分別為51.7、0.361、6.48、0.082和0.104 ng·L-1[10]。尼泊金酯類已被確定為新型污染物，其對生態(tài)和人類健康的影響一直備受科學(xué)家和公眾的關(guān)注。在生物體內(nèi)，許多化學(xué)物質(zhì)能夠影響一個以上的生物過程；同時，不同的化學(xué)物質(zhì)可能同時影響生物相似的生物過程。因此，在本研究中，擬通過CTD數(shù)據(jù)庫，分析和比較5種常見的不同的尼泊金酯化合物對生物過程影響的機制，以期為之后的相關(guān)研究提供啟發(fā)和思路。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究根據(jù)2018年8月CTD更新的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。更新后共計有38 344 568交互作用信息。核心CTD包括了1 812 207個化學(xué)物質(zhì)-基因相互作用信息，24 299 522個基因-疾病聯(lián)系信息，2 507 429個化學(xué)物質(zhì)-疾病聯(lián)系信息，以及122 725個化學(xué)物質(zhì)暴露信息。

1.2 CTD分析

進(jìn)入CTD的界面后，應(yīng)用Set Analyzer能夠分析篩選出與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相互作用的基因。將這些基因的NCBI symbols或IDs輸入CTD的Set Analyzer中，應(yīng)用Common gene-gene interactions功能，選擇Bonferroni校正P值(默認(rèn)0.01)，即可進(jìn)行基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

1.3 維恩圖制作

使用Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)軟件，計算不同尼泊金酯類影響基因列表的交集，獲得維恩圖。

1.4 KEGG通路分析

進(jìn)入DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/)后，選擇“Start Analysis”，分別提交在CTD中篩選出的與5種尼泊金酯類相互作用的全部基因，設(shè)置校正的Fisher精確檢驗EASE分值為0.2。分析完成后，選擇全部物種和“KEGG _ PATHWAY”，即可得出所需全部通路。

1.5 色階表格制作

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Microsoft Excel后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根化處理，選擇“條件格式-色階-紅白色階”，即得到紅白色階圖。在相關(guān)基因表中，表格顏色越深，代表基因出現(xiàn)的頻次越高；在KEGG通路表中，表格顏色越深，代表在該通路上富集的基因數(shù)目越多。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 相關(guān)基因分析

通過CTD數(shù)據(jù)庫，獲得與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關(guān)的基因個數(shù)分別為29、17、45、163和14。通過維恩分析，發(fā)現(xiàn)5種尼泊金酯類化合物共同影響的基因7個(表1和圖1)。如表1所示，這7個基因分別是CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CEBPA)、雌激素受體1(ESR1)、雌激素受體2(ESR2)、雌激素相關(guān)受體γ(ESRRG)、瘦素(LEP)、核受體共激活因子2(NCOA2)和過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)。這7個共同影響基因按功能大致可以2類。一類與脂代謝有關(guān)，如PPARG和CEBPA是前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的必需分子[11]；LEP則能夠通過與體內(nèi)多個信號分子相互作用，調(diào)控脂肪貯存、能量代謝和攝食行為等[12]。另一類為雌激素受體，雌激素受體在化學(xué)物雌激素樣作用過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控和介導(dǎo)作用[13]。另外，需要注意的是，核受體機制可能是尼泊金酯類重要的作用機制。在7個共同影響的基因中，5個基因為核受體(ESR1、ESR2、ESRRG和PPARG)或核受體共激活因子(NCOA2)。

圖1 維恩分析比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫中與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關(guān)的基因Fig. 1 Venn analysis for genes related to MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics Database

表1 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP共同作用的7個基因Table 1 Seven genes co-affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

在CTD數(shù)據(jù)庫中，與所有的5種尼泊金酯類相互作用的基因共計190個。為了分析這些基因之間的相互聯(lián)系，筆者進(jìn)行了基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析。如圖2所示，除LEP外，其他5個尼泊金酯類共同影響基因(CEBPA、ESR1、ESR2、ESRRG、NCOA2和PPARG)均出現(xiàn)在基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中。在基因相互網(wǎng)絡(luò)圖中，綠色圓點的面積越大、顏色越深，表明其代表的基因與其他基因的相互作用越強，越處于中心地位?？梢钥闯?，尼泊金酯類共同影響基因中的ESR1和ESR2均擁有較多關(guān)聯(lián)基因，處于中心地位(圖2)。這說明，對雌激素受體的干擾作用可能是5種尼泊金酯類化合物共同的重要毒性機制。體外研究表明，尼泊金酯類能夠與ESR1和ESR2結(jié)合[14]，屬于環(huán)境化學(xué)物的雌激素樣作用的典型作用機制。尼泊金酯類與雌激素受體的親和力比17β-雌二醇(E2)低幾個數(shù)量級；BuP效力最強，比E2低約10 000倍[15]。盡管作用微弱，但由于不同尼泊金酯類在環(huán)境或人體中經(jīng)常同時存在，它們之間還可能存在協(xié)同效應(yīng)[16]，因此，尼泊金酯類化合物復(fù)合暴露風(fēng)險的評估在今后研究中不容忽視。雌激素受體不管在雌性還是雄性動物的生殖中均具有重要作用。體內(nèi)研究已經(jīng)證實，尼泊金酯類能夠誘導(dǎo)嚙齒類動物子宮增生，干擾子宮組織學(xué)，影響雄性動物生殖參數(shù)[2]。

除了ESR1和ESR2，發(fā)現(xiàn)主要卵黃蛋白(MYP)(ID為373376)、腫瘤蛋白p53(TP53)(ID為7157)與神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1(NTRK1)(ID為4914)在基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)中處于較中心的地位。MYP為非哺乳類卵生雌性動物的一種特異性蛋白，又稱卵黃蛋白原(Vtg)[17]，是維持卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)。在生態(tài)毒理學(xué)中，Vtg已經(jīng)成為一種靈敏的環(huán)境雌激素和類雌激素效應(yīng)的生物標(biāo)志物。對MYP的干擾作用最終將影響動物的生殖和胚胎發(fā)育。TP53是一種廣譜腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物為多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)的作用[18]。事實上，尼泊金酯類化合物是在乳腺腫瘤中檢出后，開始引起人們的關(guān)注[19]，并已證實，尼泊金酯可以在體外誘導(dǎo)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的增殖[20]。NTRK1介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)生長因子信號傳導(dǎo)的多個作用，如促進(jìn)神經(jīng)元的增殖或分化[21]。由于MYP、TP53和NTRK1不屬于尼泊金酯類共同作用基因，無法推斷所有尼泊金酯類是否都能夠通過這3個基因分別介導(dǎo)生殖毒性、致癌性和神經(jīng)毒性。但當(dāng)所有的尼泊金酯類同時出現(xiàn)在環(huán)境或人體內(nèi)時，可能誘導(dǎo)這些組合效應(yīng)。

圖2 應(yīng)用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫分析與MeP、EtP、PrP、BuP和BzP相關(guān)的所有基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)注：實線圈表示共同作用基因；虛線圈表示非共同作用基因，但處于較中心地位。Fig. 2 Network map of all genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP in Comparative Toxicogenomics DatabaseNote: The solid circles represent co-acting genes; the dotted circles represent non-co-acting genes but locate in more central positions.

基于維恩分析和基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果，尼泊金酯類化合物可能具有弱雌激素效應(yīng)和干擾脂代謝毒性作用。因此，筆者分別整理了與尼泊金酯類化合物相互作用的與生殖(表2)和脂代謝(表3)相關(guān)基因。

表2 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的與生殖有關(guān)基因Table 2 Reproduction-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

表3 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的與脂代謝有關(guān)基因Table 3 Lipid metabolism-related genes affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

一般認(rèn)為尼泊金酯類化合物的雌激素活性隨著烷基鏈的長度(甲基<乙基<丙基<丁基<異丁基)而增加。因此，長鏈尼泊金酯類，如BuP和PrP最受關(guān)注[22]。根據(jù)表2的結(jié)果，與BuP相互作用的基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次均較高，其次是PrP。與BzP相關(guān)的基因數(shù)目最少，僅3個。值得注意的是，除雌激素受體外，BuP和PrP均能夠和雄激素受體(AR)相互作用，MeP、BuP和PrP還能夠與G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(GPER1)相互作用。特別是GPER1，屬于膜受體，不同于傳統(tǒng)核受體(如ESR和AR)，其通過非基因組方式介導(dǎo)雌激素效應(yīng)，可快速且持久地激活細(xì)胞內(nèi)不同的雌激素信號通路，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖及功能[23]。這提示，尼泊金酯類化合物通過激素受體介導(dǎo)的毒性機制的復(fù)雜性。除了性激素受體介導(dǎo)的毒性機制外，尼泊金酯類化合物還可能影響激素的合成與轉(zhuǎn)運。MeP、BuP和PrP均能影響細(xì)胞色素P45019A1(CYP19A1)，其編碼產(chǎn)物芳香化酶是雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶，是雌激素合成的關(guān)鍵酶之一[24]；除BuP外，其他尼泊金酯類均能影響SHBG，其能夠特異性地與性激素相結(jié)合并參與其轉(zhuǎn)運，調(diào)控血液中生物活性性激素的水平[25]。

由表3可知，與BuP相互作用的與脂代謝有關(guān)基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次最高，其次是PrP和BzP。盡管與BzP影響的性激素有關(guān)基因數(shù)量和出現(xiàn)頻次較低，但與其脂代謝有關(guān)的基因數(shù)量和頻次卻較高(表3)。根據(jù)篩選的脂代謝有關(guān)基因，可以推斷，對脂肪細(xì)胞分化的影響可能是尼泊金酯類化合物影響脂代謝的主要作用機制。如前所述，共同影響基因PPARG和CEBPA是脂肪前體細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；而脂肪酸合成酶(FASN)是機體脂肪酸合成的主要限速酶，脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4)能夠參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運和靶向定位，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化[26]。另外，脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的重要組成部分，也是內(nèi)源性大麻類物質(zhì)的水解酶[27]。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可調(diào)節(jié)脂肪生成和能量穩(wěn)態(tài)[28]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中的花生四烯酰乙醇酰胺可直接結(jié)合PPARG介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分化[29-30]。尼泊金酯類還能夠影響脂肪因子的分泌，如LEP和脂聯(lián)素(ADIPOQ)。LEP和ADIPOQ是脂肪組織合成的最豐富的脂肪因子，在能量穩(wěn)態(tài)和食欲調(diào)節(jié)中起重要作用[31]。

2.2 相關(guān)KEGG通路分析

通過對富集基因個數(shù)>5的KEGG通路分析，篩選到大量與生殖相關(guān)通路，但并未篩選到與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的通路，如PPAR信號通路。有意思的是，在篩選出的通路中，有大量與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關(guān)的通路。與BuP相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)或功能通路最多，還有少量通路與PrP相關(guān)。盡管僅發(fā)現(xiàn)BuP和PrP富集到與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關(guān)的通路，但其他尼泊金酯類可能對神經(jīng)系統(tǒng)也可能有相似的影響。最近的流行病學(xué)調(diào)查研究表明，孕婦尿液MeP和總尼泊金酯類水平與2歲時女童神經(jīng)認(rèn)知發(fā)育受損有關(guān)[32]。動物實驗也表明，0.1 μg·L-1和1 μg·L-1的MeP暴露能夠誘導(dǎo)斑馬魚(Daniorerio)幼魚焦慮行為[33]；孕早期至斷奶期暴露于BuP后，在誘導(dǎo)雄性仔鼠類似于自閉癥VA模型中觀察到的神經(jīng)發(fā)育障礙[34]。最近有研究表明，盡管BuP暴露濃度低于影響生殖的最低可見有害作用水平(LOAEL)，并沒有顯示出雌激素活性和影響性腺發(fā)育和生育能力的效應(yīng)，但卻能夠影響生殖行為[35]。這提示，神經(jīng)-行為學(xué)較生殖相關(guān)指標(biāo)可能對尼泊金酯類的暴露更加敏感。但相較于生殖毒性，尼泊金酯類神經(jīng)毒性的研究還較少。因此，尼泊金酯對神經(jīng)系統(tǒng)或功能的研究在今后應(yīng)該加強。另外需要注意的是，本研究未篩選出任何通路與BzP相關(guān)，這可能與對BzP的毒性開展研究較少有關(guān)。在人體和環(huán)境尼泊金酯類調(diào)查研究中，BzP檢出率和濃度相對其他尼泊金酯化合物均較低[6-10]。但最近，Valle-Sistac等[36]通過對志愿者胎盤中尼泊金酯類水平的調(diào)查，第一次發(fā)現(xiàn)BzP在胎盤中普遍存在。與其他尼泊金酯類不同，BzP不僅用作防腐劑，還廣泛用作制藥、印染/農(nóng)藥生產(chǎn)的中間體，這可能增加其暴露途徑和水平。因此，今后應(yīng)加強BzP毒性研究，為其生態(tài)和健康風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

篩選出與生殖有關(guān)的通路(表4)主要包括兩大類：一類與生殖相關(guān)激素的合成、分泌及活性有關(guān)，如甾類激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、卵巢類固醇生成(ovarian steroidogenesis)、催乳激素信號通路(prolactin signaling pathway)、促性腺激素釋放激素信號通路(GnRH signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、催產(chǎn)素信號通路(oxytocin signaling pathway)；另一類則主要與卵巢發(fā)育有關(guān)，如母細(xì)胞減數(shù)分裂(oocyte meiosis)、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)通路。

在KEGG通路富集分析中，甾類激素生物合成通路、甲狀腺激素信號通路以及催產(chǎn)素信號通路可能都還與脂代謝或肥胖有關(guān)。甾類激素生物合成通路不僅與類固醇激素前體有關(guān)，還涉及膽固醇生物合成[37]；甲狀腺激素信號通路除了有助于維持垂體-性腺軸的穩(wěn)定，影響生殖功能外，在能量代謝穩(wěn)態(tài)中也起重要作用[38]；而催產(chǎn)素信號通路除了在分娩、哺乳等生殖相關(guān)過程中產(chǎn)生功能外，還通過LEP調(diào)控食欲和脂肪代謝[39]。另外，催產(chǎn)素信號通路還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，能夠調(diào)節(jié)動物的親社會行為(如孤獨癥)。因此，催產(chǎn)素信號通路可能介導(dǎo)了尼泊金酯類的多個相關(guān)毒性。

在與神經(jīng)系統(tǒng)或功能相關(guān)的通路中，多個通路與化學(xué)突觸有關(guān)，包括谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse)、GABA能突觸(GABAergic synapse)、5-羥色胺能突觸(serotonergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)和多巴胺能神經(jīng)突觸(dopaminergic synapse)。因此，尼泊金酯類可能通過影響化學(xué)性神經(jīng)突觸，進(jìn)而影響突觸信號傳遞及神經(jīng)系統(tǒng)的通訊功能。此外，神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路能夠介導(dǎo)從細(xì)胞外環(huán)境到細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控突觸的可塑性[40]。在逆向內(nèi)源性大麻素神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，內(nèi)源性大麻素以活動依賴性方式從神經(jīng)元釋放，逆行作用于突觸前CB1大麻素受體，并調(diào)節(jié)遞質(zhì)釋放；這種逆行信號傳導(dǎo)與短期和長期突觸的可塑性有關(guān)，并且有助于某些形式的學(xué)習(xí)和記憶[41]。神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路的功能包括促進(jìn)神經(jīng)元生長、發(fā)育和分化，保護(hù)受損神經(jīng)元細(xì)胞免于死亡，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和再生，加強突觸間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[42]；還能夠參與空間學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能和人格發(fā)展以及各種精神疾病的發(fā)病機制，包括情緒障礙、精神分裂癥和孤獨癥等[34]。軸突導(dǎo)向通路在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成過程中起到非常重要作用[43]。筆者還篩選出2個與誘發(fā)神經(jīng)性疾病相關(guān)的通路，分別是阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)通路和長期異型突觸性抑郁(long-term depression)通路。

表4 MeP、EtP、PrP、BuP和BzP影響的有關(guān)KEGG通路Table 4 KEGG pathways affected by MeP, EtP, PrP, BuP and BzP

隨著尼泊金酯類化合物使用規(guī)模和范圍逐漸擴大，其作為新興污染物對人類健康影響的研究亟需開展，以便對其進(jìn)行更加全面的健康風(fēng)險評估。由于其抗微生物作用，尼泊金酯化合物還可能干擾腸道共生微生物與人體構(gòu)成的“超級共生體”，對人類健康產(chǎn)生間接影響。腸道共生微生物與人體的代謝、營養(yǎng)和免疫，甚至神經(jīng)系統(tǒng)與精神健康等生理功能密切相關(guān)，是重要的“微生物器官”[44]。因此，尼泊金酯化合物對生殖、脂代謝以及神經(jīng)系統(tǒng)的潛在影響，是否與其對腸道共生微生物與人體構(gòu)成的共生體有關(guān)，應(yīng)該在今后的研究中引起關(guān)注。