劉麗華，于 洋，白 巖，劉業(yè)輝，于凱歌，丁 寧

當(dāng)前，由于使用化學(xué)農(nóng)藥引發(fā)的環(huán)境污染、殘留、病蟲害抗藥性等問(wèn)題，極大地威脅了人類本身及環(huán)境的安全.針對(duì)現(xiàn)今農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展理論，開發(fā)植物源農(nóng)藥是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵性手段，利用天然植物活性成分創(chuàng)制新型、高效、低毒殺蟲劑備受人們重視［1].長(zhǎng)白山野生植物資源非常豐富，其中有毒植物資源種類繁多，達(dá)到160多種，它們能夠產(chǎn)生生物堿、類萜、類黃酮、精油等多種性質(zhì)各異的次生代謝物，在殺蟲、抑菌等方面均有一定表現(xiàn)［2].長(zhǎng)白山大多有毒植物在醫(yī)藥上被使用，少數(shù)在民間作為殺蟲農(nóng)藥使用，極大地限制了長(zhǎng)白山有毒植物的應(yīng)用和開發(fā).

東北天南星（Arisaema amurense Maxim.）屬天南星科天南星屬多年生草本植物，為常用中藥，具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫的功效［3].其化學(xué)成分以生物堿、黃酮類、多糖為主，另外還有氨基酸、脂肪酸及甾醇等成分［4].現(xiàn)代藥理研究表明，生物堿具有顯著的生物活性，是其重要的有效成分之一，具有抗腫瘤［5]、抗菌［6]、抗氧化［7]、昆蟲毒殺［8]等作用.目前，對(duì)天南星的研究在化學(xué)成分和藥理作用及機(jī)制等方面都有新的報(bào)道［9-10]，但在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治方面，其殺蟲機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道.

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）也稱秋黏蟲，廣泛分布于美洲大陸且遷飛能力較強(qiáng)的毀滅性農(nóng)業(yè)害蟲［11].草地貪夜蛾幼蟲可取食玉米、水稻、小麥、棉花等300多種寄主作物［12].自2019年1月云南省首次發(fā)現(xiàn)該蟲危害玉米以來(lái)，其發(fā)生危害地區(qū)逐漸擴(kuò)大，目前已有20 多個(gè)省（區(qū)）發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾［13].鑒于草地貪夜蛾在我國(guó)擴(kuò)散速度之快，潛在地理分布之廣，危害作用之強(qiáng)，故以草地貪夜蛾Sf 21 細(xì)胞系為靶標(biāo)，利用植物源殺蟲劑對(duì)其殺蟲活性及機(jī)制進(jìn)行研究尤為重要.

為此，本文以顯著殺蟲活性的長(zhǎng)白山有毒植物東北天南星為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)現(xiàn)代提取分離手段制備其生物總堿，采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT 法）檢測(cè)東北天南星生物總堿對(duì)離體培養(yǎng)草地貪夜蛾Sf 21 細(xì)胞毒性影響，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)其細(xì)胞凋亡的影響，從而在細(xì)胞及分子水平上深入研究和揭示天南星毒性作用機(jī)制，以期為天南星科植物開發(fā)為植物源殺蟲劑提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

Sf 21細(xì)胞株由江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng).細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100 及胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，MTT 購(gòu)自華美生物工程公司，二甲基亞砜（DMSO）為Sigma 公司產(chǎn)品，Annexin V 細(xì)胞凋亡試劑購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司.東北天南星采自吉林省通化市頭道溝，由通化師范學(xué)院植物組教研室鑒定確認(rèn).

1.2 方法

（1）東北天南星生物總堿的提取.稱取東北天南星干燥的地下根莖50 g，采用甲醇浸提，減壓蒸餾獲得粗提取物，進(jìn)一步分離出生物總堿，生物總堿的提取方法參考武剛毅等［14]的方法進(jìn)行.用DMSO 溶解東北天南星生物堿，臨用前用TC-100 培養(yǎng)液稀釋成質(zhì)量濃度為10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL的藥液，置于4 ℃培養(yǎng)箱中備用.

（2）細(xì)胞培養(yǎng).Sf 21 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的TC-100 培養(yǎng)基于27 ℃培養(yǎng).2～3 d換培養(yǎng)基1次，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%以上面積時(shí)應(yīng)及時(shí)分瓶傳代.

（3）MTT 法測(cè)定細(xì)胞抑制率.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf 21 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，以100 uL/孔種入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，各試驗(yàn)孔中加入東北天南星藥液，使培養(yǎng)液中天南星終濃度分別為10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL，對(duì)照組加入100 uL 培養(yǎng)液，調(diào)零孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液.每組均設(shè)3 個(gè)重復(fù)，置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，各培養(yǎng)孔中加入80 uL培養(yǎng)液和20 uL MTT溶液（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 uL DMSO，置微量震蕩器低速震蕩10 min，使形成的甲臜完全溶解，490 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)各濃度的吸光值，計(jì)算抑制率的公式如下：

（4）流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率.Sf 21 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)不同濃度東北天南星作用48 h 后，采用Annexin V-FIFC/PI雙熒光標(biāo)記，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明，用流式細(xì)胞儀分析Sf 21細(xì)胞凋亡情況.

（5）數(shù)據(jù)分析.圖表采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析.

表1 不同濃度東北天南星生物總堿對(duì)Sf 21細(xì)胞的抑制作用（xˉ±s）

2 結(jié)果與分析

2.1 東北天南星生物堿對(duì)Sf 21細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度東北天南星生物總堿對(duì)Sf 21 細(xì)胞均有抑制作用，如表1 所示，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)及藥物濃度的增大，抑制率明顯增加.50 ug/mL 劑量組在72 h 基本上不存在活細(xì)胞.提示藥物作用具有明顯的劑量和時(shí)間依賴性.

2.2 東北天南星生物堿對(duì)Sf 21細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的東北天南星生物總堿分別作用于Sf 21細(xì)胞48 h后，分別取各處理細(xì)胞經(jīng)Annexin V-FIFC/PI 雙染后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率.結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各劑量組均可誘導(dǎo)Sf 21 細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著東北天南星質(zhì)量濃度（10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL）的增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸增加，分別為18.4%、35.2%、62.5%.表明東北天南星誘導(dǎo)Sf 21 細(xì)胞凋亡作用呈劑量依賴性.具體細(xì)胞凋亡率如圖1所示.

圖1 不同處理?xiàng)l件下Sf 21細(xì)胞凋亡率

3 討論

近年來(lái)，由于化學(xué)農(nóng)藥的弊端日益凸顯（殘留、抗性、環(huán)境污染），特別是環(huán)境保護(hù)和生態(tài)平衡問(wèn)題，使化學(xué)農(nóng)藥受到嚴(yán)重挑戰(zhàn).對(duì)植物源殺蟲劑的研究與開發(fā)是當(dāng)前創(chuàng)新型農(nóng)藥研制的熱點(diǎn)［15].東北天南星作為具有殺蟲活性植物之一，對(duì)其細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究有助于為把東北天南星開發(fā)為植物源殺蟲劑提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù).關(guān)于東北天南星根提取物對(duì)細(xì)胞的毒性［16]和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響［17-18]等已有一些報(bào)道，但對(duì)于昆蟲細(xì)胞的毒性及細(xì)胞凋亡作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道.

本研究中東北天南星對(duì)Sf 21細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制作用較明顯，其細(xì)胞抑制率與藥物濃度、作用時(shí)間呈劑量依賴性，即隨著東北天南星藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也相應(yīng)增加.這與湯建華［19]等用天南星醇提取液作用人胃癌細(xì)胞結(jié)果相同.

流式細(xì)胞儀檢測(cè)了Sf 21 細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，東北天南星具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)Sf 21 細(xì)胞凋亡的作用，隨著藥液質(zhì)量濃度增大，細(xì)胞凋亡的比例明顯增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng).由此可見(jiàn)，天南星生物堿可能是通過(guò)誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡達(dá)到殺蟲的目的，黃維林［20]等研究結(jié)果表明，肺癌A549細(xì)胞在天南星總黃酮作用下發(fā)生凋亡也與藥物濃度呈劑量相關(guān)性.但由于昆蟲細(xì)胞和癌癥細(xì)胞理化性質(zhì)的不同，其誘導(dǎo)凋亡的網(wǎng)絡(luò)和途徑也不同，因此對(duì)其凋亡機(jī)制研究還有待于進(jìn)一步研究.同時(shí)，本文研究的是東北天南星生物總堿，今后將進(jìn)一步分離純化殺蟲活性成分，明確各種活性成分的作用及相互關(guān)系，尋找具有農(nóng)藥活性的先導(dǎo)化合物，進(jìn)而研制出新型植物源農(nóng)藥.