胡小祥，何 艷

（1. 郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 郴州 423000； 2. 湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000）

骨折挫傷膠囊由豬骨、炒黃瓜子、煅自然銅、紅花、大黃、當(dāng)歸、醋乳香、醋沒(méi)藥、血竭、土鱉蟲10 味藥材組方，具有舒筋活絡(luò)、接骨止痛的功效，主治跌打損傷、消腫散瘀、扭腰岔氣等癥[1]1188?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，含量測(cè)定項(xiàng)下僅以血竭素為指標(biāo)成分來(lái)控制血竭的質(zhì)量，未對(duì)處方中紅花和大黃等藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。方中紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛，主要成分為羥基紅花色素A[1]151；大黃逐瘀通經(jīng)、跌打損傷，主要成分為大黃素[1]23。目前，關(guān)于該制劑中羥基紅花色素A 和大黃素的含量測(cè)定采用不同液相色譜法進(jìn)行單獨(dú)測(cè)定[2-3]，耗時(shí)費(fèi)力。本研究中擬建立同時(shí)測(cè)定該制劑中羥基紅花色素A 和大黃素含量的高效液相色譜（HPLC）法，為控制該制劑的質(zhì)量提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置G1315D 型DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；AUW-220D 型電子天平（日本島津公司，感量為0.01 mg）；KQ-300DE 型超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

骨折挫傷膠囊（廠家A，批號(hào)分別為180103，171001；廠家B，批號(hào)為20170602）；羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)為111637-2013086，純度為96.5%），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756-201512，純度為98.7%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters sunfire-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～9 min 時(shí)15% A，9 ～10 min 時(shí)15%A→85% A，10 ～25 min 時(shí)85% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm（0 ～10 min），254 nm（10 ～25 min）；流速：1.0 mL/min，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取骨折挫傷膠囊樣品（批號(hào)分別為180103，171001，20170602）內(nèi)容物適量，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

混合對(duì)照品溶液：分別稱取羥基紅花黃色素A 和大黃素對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為42.54μg/mL 和40.80 μg/mL 的混合對(duì)照品貯備溶液。

陰性對(duì)照品溶液：取按處方工藝制備陰性樣品，取適量，研細(xì)，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。供試品溶液中羥基紅花黃色素A 和大黃素色譜峰可達(dá)到較理想的分離效果，分離度大于1.5；且陰性對(duì)照品溶液在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得羥基紅花黃色素A、大黃素回歸方程分別為Y羥=28.014X-0.793（r=0.999 8），Y大=36.835X-0.342（r=0.999 8）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A、大黃素質(zhì)量濃度分別在2.12 ～29.68 μg/mL，2.04 ～28.36 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果羥基紅花黃色素A 和大黃素峰面積的RSD分別為0.77%和0.57%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一批（批號(hào)為180103）供試品溶液10 μL，分別于0，4，8，12，16，24 h 時(shí)重復(fù)進(jìn)樣。結(jié)果羥基紅花黃色素A 和大黃素峰面積的RSD分別為1.11%和1.36%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為180103）樣品6 份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果羥基紅花黃色A 和大黃素平均含量分別為0.228mg/g 和0.108mg/g，RSD分別為1.67%和1.21% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的（批號(hào)180103）樣品9份，約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按樣品中含羥基紅花黃色素A 和大黃素的50%，100%，150%分別精密加入混合對(duì)照品溶液50 mL，按2.2 項(xiàng)下方法各平行制備3 份供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同廠家的樣品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果羥基紅花黃色素A 和大黃素的含量，廠家A（批號(hào)為180103）分別為0.228 mg/g 和0.108 mg/g，廠家A（批號(hào)為171001）分別為0.266 mg/g和0.110 mg/g，廠家B（批號(hào)為20170602）分別為0.159 mg/g 和0.051 mg/g（n=3）。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

采用DAD 檢測(cè)器，對(duì)羥基紅花黃色素A 和大黃素混合對(duì)照品在200 ～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A 最大吸收波長(zhǎng)為403 nm，大黃素最大吸收波長(zhǎng)為254 nm。所用檢測(cè)器具有波長(zhǎng)切換功能，故本研究中選用403，254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)[4-7]，比較了乙腈-0.5%乙酸溶液，乙腈-0.2%磷酸溶液，甲醇-0.5%乙酸溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相對(duì)供試品溶液進(jìn)行分離。結(jié)果表明，采用甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，羥基紅花黃色素A 和大黃素分離效果好，分離度均大于1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.2 提取條件選擇

本研究中比較了甲醇、70%甲醇、乙醇和70%乙醇作為提取溶劑時(shí)的提取效果。采用乙醇和70%乙醇作為溶劑時(shí)，雜質(zhì)較多，目標(biāo)峰有干擾；采用甲醇、70%甲醇作為提取溶劑時(shí)，2 種有效成分在以甲醇為提取溶劑時(shí)得率最高，且測(cè)定無(wú)干擾，最終選擇甲醇作為提取溶劑。同時(shí)還考察了加熱回流提取和超聲提取2 種提取方法的效果，結(jié)果顯示，2 種提取方法對(duì)2 種有效成分提取的影響相似，但超聲提取簡(jiǎn)單易行，故最終選擇超聲提取。以甲醇作為提取溶劑時(shí)，考察了超聲提取10，20，30，40 min 對(duì)2 種有效成分提取的影響，超聲提取30 min時(shí)，2 種有效成分基本提取完全，故選擇超聲提取30 min處理供試品。