時(shí)浩清，訾曉淵，張春雷，楊琦，孫穎浩

(海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海200433)

前列腺癌在男性癌癥發(fā)病率中占第3位，病死率占第6位[1,2]，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚未明了。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類由線性RNA前體的5′端和3′端共價(jià)相連形成的、具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的非編碼RNA[3]，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前大部分circRNA包含若干個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，具有miRNA海綿的功能，是一種新型的競爭性內(nèi)源RNA。也有研究顯示，circRNA可與U1 snRNP、RNA聚合酶Ⅱ等蛋白相互作用，參與調(diào)控親本基因的表達(dá)[4,5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circRNA-1565在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高。2017年5月～2018年5月，本研究觀察了circRNA-1565對前列腺癌PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：前列腺癌PC-3細(xì)胞、人腎上皮293T細(xì)胞均購自美國ATCC細(xì)胞庫，并培養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室。主要試劑：FBS、培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，siRNA分子由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，Mir-X miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，RNA酶購自美國Invitrogen公司，Lipofectamine2000?購自美國Thermo Fisher公司，小鼠抗人磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制子1(SNAIL1)、β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體均購自美國CST公司。

1.2 circRNA-1565對PC-3細(xì)胞生物學(xué)行為影響的觀察

1.2.1 circRNA-1565小干擾RNA(siRNA)篩選 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。PC-3細(xì)胞采用含10%FBS、1%青-鏈霉素的F12培養(yǎng)液，使用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況,2～3 d更換1次培養(yǎng)基。設(shè)計(jì)兩條不同的siRNA(si445、si446)，待PC-3細(xì)胞融合至約90%時(shí)，分別將其轉(zhuǎn)染進(jìn)PC-3細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞總RNA抽提，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度及純度合格，反轉(zhuǎn)錄后使用Step One Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算干擾效率。結(jié)果顯示，si445與si446的干擾效率均在80%以上，均符合實(shí)驗(yàn)要求，本研究選擇si445進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 將PC-3細(xì)胞分為觀察組和對照組，分別轉(zhuǎn)染si445和陰性對照siRNA，轉(zhuǎn)染24 h。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8法。待PC-3細(xì)胞融合至50%～80%時(shí)，消化細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，密度為1×105/mL。取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板。參照1.2.2進(jìn)行細(xì)胞分組處理，轉(zhuǎn)染48 h。每孔加入10 mg/mL CCK-8溶液10 μL、新鮮培養(yǎng)液100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度值(OD450)，連續(xù)檢測5 d。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成能力觀察 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染24 h的兩組細(xì)胞，消化細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×102/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d，每隔3 d進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，直到絕大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)大于50的克隆數(shù)。吸棄培養(yǎng)皿內(nèi)溶液，使用甲醛固定細(xì)胞30～60 min。吸去固定液，PBS沖洗2次，加入Giemsa染液500 μL進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)兩組克隆形成個(gè)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡能力觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取轉(zhuǎn)染24 h的兩組細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后重懸，取100 μL單細(xì)胞懸液，加入5 μL AV-FITC，室溫避光10 min。每管加100 μL的上樣緩沖液及5 μL PI，輕輕混勻細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。待PC-3細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)接種于6孔板，參照1.2.2進(jìn)行細(xì)胞分組處理，轉(zhuǎn)染24 h。用無菌10 μL槍頭垂直培養(yǎng)器底部勻力劃線，更換含有1%血清的新鮮培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)0、12 h于固定位置取樣，計(jì)算細(xì)胞移動距離。

1.2.7 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。待PC-3細(xì)胞融合至50%～80%時(shí)，消化細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，按照1×105/mL接種于24孔板。參照1.2.2進(jìn)行細(xì)胞分組處理，轉(zhuǎn)染24 h。用微量移液管將200 μL單細(xì)胞懸液加入直徑為8 μm的24孔板Transwell上室中，下室加入500 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。輕輕拂去上室中的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.3 與circRNA-1565結(jié)合的miRNA篩選 采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將生物素標(biāo)記的探針和非特異性空白對照探針按200 mmol/L轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。甲醛固定，加入1 mL裂解液，刮取細(xì)胞并靜置10 min。超聲處理樣品，10 000 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。將帶鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠M-280充分混勻，分裝至1.5 mL EP管中，每管100 μL，用RNase-free的BSA和酵母tRNA進(jìn)行包被。將所獲得上清與預(yù)處理的磁珠混合，加入200 μL裂解液進(jìn)行重懸，放置2 h進(jìn)行解交聯(lián)。結(jié)果顯示，circRNA-1565的探針能夠富集miRNA 87條(fold>2)，其中顯著上調(diào)的有28條(fold>10)。結(jié)合TargetScan[6,7]和Miranda[8,9]生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的注釋，選擇miR-21和miR-153進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 circRNA-1565對miR-21和miR-153的調(diào)控作用觀察 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將circRNA-1565的miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列克隆到報(bào)告基因質(zhì)粒的R-Luc 3′UTR區(qū)，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將能夠表達(dá)miR-21和miR-153的前體序列分別克隆到過表達(dá)質(zhì)粒pEX-3中，構(gòu)建pEX-miR-21過表達(dá)質(zhì)粒、pEX-miR-153過表達(dá)質(zhì)粒。利用Lipofectamine2000?將pEX-miR-21過表達(dá)質(zhì)粒、pEX-miR-153過表達(dá)質(zhì)粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒pEX-NC分別與熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，加入F-Luc底物檢測熒光強(qiáng)度，再加入R-Luc底物檢測熒光強(qiáng)度，以后者與前者熒光強(qiáng)度的比值計(jì)算報(bào)告基因活性。

1.5 miR-21、miR-153對circRNA-1565干擾的PC-3細(xì)胞侵襲、遷移能力影響的觀察 將PC-3細(xì)胞分為si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染si445、si445+miR-21 inhibitor、si445+miR-153 inhibitor及陰性對照siRNA，參照1.2.6和1.2.7的方法分別觀察細(xì)胞遷移、侵襲能力。

1.6 細(xì)胞PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。將PC-3細(xì)胞隨機(jī)分為si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染si445、si445+miR-153 inhibitor、陰性對照siRNA。轉(zhuǎn)染24 h加入細(xì)胞裂解液150 μL，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，置入轉(zhuǎn)膜夾，以300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜1.5 h。將PVDF膜取出，標(biāo)記正面，置入封閉液中，置于平板蕩器上，室溫封閉2 h。加入PI3K、PTEN、SNAIL1、β-actin一抗(稀釋比例分別為1∶750、1∶750、1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比例均為1∶2 000)，室溫孵育2 h。DBA顯色，采用BioRAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光， Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較 觀察組與對照組不同時(shí)間點(diǎn)OD450、克隆形成個(gè)數(shù)、細(xì)胞凋亡率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。觀察組進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)、細(xì)胞移動距離均低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 circRNA-1565對miR-21和miR-153的調(diào)控作用 轉(zhuǎn)染pEX-miR-21過表達(dá)質(zhì)粒、pEX-miR-153過表達(dá)質(zhì)粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153過表達(dá)質(zhì)粒與陰性對照質(zhì)粒pEX-NC的293T細(xì)胞報(bào)告基因活性分別為0.43±0.11、0.49±0.10、0.21±0.06、1.00±0.07，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒pEX-NC的293T細(xì)胞報(bào)告基因活性高于轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒的293T細(xì)胞(P均<0.05)。

2.3 si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 si445組、si445+miR-21 inhibitor組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(77±7)、(97±6)、(174±8)、(212±8)個(gè)，細(xì)胞移動距離分別為(1.0±0.1)、(1.4±0.1)、(2.8±0.3)、(3.1±0.2)μm；與陰性對照組比較，其余三組進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)、細(xì)胞移動距離均降低，且si445組、si445+miR-21 inhibitor組降低更明顯(P均<0.05)。si445組、si445+miR-21 inhibitor組進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)、細(xì)胞移動距離比較P均>0.05。

2.4 si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細(xì)胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表達(dá)比較 si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細(xì)胞PI3K蛋白相對表達(dá)量依次升高(P均<0.05)，三組細(xì)胞PTEN和SNAIL1蛋白相對表達(dá)量比較P均>0.05。見表2、圖1。

表2 三組細(xì)胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白相對表達(dá)量比較

注：與陰性對照組比較，*P<0.01；與si445+miR-153 inhibitor組比較，#P<0.05。

3 討論

我國前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于晚期，且多存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位包括骨、肺和肝臟等，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明，但可以肯定其轉(zhuǎn)移是多種復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)異常的結(jié)果[11]。近年來，RNA-Seq等研究手段日漸成熟，非編碼RNA的作用逐漸得到重視，并發(fā)現(xiàn)了一種新的內(nèi)源性非編碼RNA類型——circRNA。circRNA是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的非編碼RNA[3]，具有穩(wěn)定性、組織細(xì)胞發(fā)育的時(shí)空特異性以及保守性等生物學(xué)特性，在基因調(diào)控過程中具有重要作用[12,13]。circRNA并不是細(xì)胞中的“剪切副產(chǎn)物”，而是細(xì)胞內(nèi)不可或缺的部分，具有重要的生物學(xué)功能。circRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14～19]，并有望成為腫瘤的新型生物標(biāo)志物甚至治療靶點(diǎn)，但其在前列腺癌中的研究甚少。本課題組在前期研究中對前列腺癌細(xì)胞RNA抽提并質(zhì)檢后進(jìn)行circRNA測序，成功鑒定出差異表達(dá)的circRNA共300余條，其中上調(diào)表達(dá)的有85條；根據(jù)PCR檢測結(jié)果，結(jié)合circBase等公共數(shù)據(jù)庫的注釋以及既往相關(guān)研究，最終選定circRNA-1565作為研究對象，并證實(shí)其在轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量高，在非轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量低，在前列腺正常細(xì)胞系中表達(dá)量極低。

注：A為陰性對照組，B為si445組，C為si445+miR-153 inhibitor組。

圖1三組細(xì)胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

siRNA是最方便和廣泛的一種人工合成下調(diào)目的基因表達(dá)方式，其作用在mRNA和LncRNA的研究中得到有效驗(yàn)證。但對circRNA而言，由于其空間結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，siRNA的效果很難保證。為了避免脫靶效應(yīng)，circRNA的siRNA必須靶向設(shè)計(jì)在接頭部位，否則就會造成假陽性。因此，本研究設(shè)計(jì)了兩條不同的siRNA(si445、si446)，其干擾效率均在80%以上，均符合實(shí)驗(yàn)要求，選擇si445進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞移動距離明顯短于對照組，進(jìn)入下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)少于對照組，但兩組細(xì)胞OD450、克隆形成個(gè)數(shù)及細(xì)胞凋亡率比較均無明顯差異；這說明circRNA-1565可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移，但不能影響前列腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡。

本研究雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-21、miR-153可通過結(jié)合circRNA-1565來抑制報(bào)告基因熒光素酶活性，說明circRNA-1565可以分別與miR-21和miR-153直接結(jié)合，即circRNA-1565可以通過競爭性結(jié)合miR-21和miR-153來發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示，miR-153 inhibitor可以促進(jìn)circRNA-1565干擾的PC-3細(xì)胞侵襲與遷移，而miR-21 inhibitor的效果則不明顯；說明miR-153參與了circRNA-1565介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞侵襲與遷移，而miR-21雖然也可被circRNA-1565調(diào)控，但并不參與其介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞侵襲與遷移。通過查閱TargetScan和Miranda等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對miR-153的注釋，并結(jié)合既往研究證據(jù)，選定miR-153有PI3K、PTEN、SNAIL1等幾個(gè)下游靶點(diǎn)。PI3K目前已知對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡均有影響，是一種主要的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制多種細(xì)胞再生過程。本研究結(jié)果表明，si445組、si445+miR-153 inhibitor組、陰性對照組細(xì)胞PI3K蛋白相對表達(dá)量依次升高，三組細(xì)胞PTEN和SNAIL1蛋白相對表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；這說明circRNA-1565可通過沉默miR-153來調(diào)控下游靶蛋白PI3K表達(dá)，該調(diào)控機(jī)制與PTEN、SNAIL1蛋白無關(guān)。

綜上所述，circRNA-1565可促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞侵襲和遷移，其機(jī)制可能與競爭性結(jié)合miR-153并沉默其下游靶蛋白PI3K表達(dá)有關(guān)。