王曉東 迪麗努爾·塔西買買提 迪麗達(dá)爾·地里夏提 哈地利亞·哈斯木 帕麗達(dá)·阿布利孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830054)

孢子絲菌病(sporotrichosis)是由孢子絲菌屬菌種(Sporothrixspp.)引起的人畜共患真菌性疾病，該病在全球均有發(fā)生，但尚無明確的流行病學(xué)數(shù)據(jù)[1-3]，我國(guó)東北、新疆等均有感染患者[4-5]。近年來，孢子絲菌屬菌種在免疫低下患者中引起的系統(tǒng)性感染也在不斷增多。孢子絲菌病的發(fā)病機(jī)制與病原體毒力和宿主免疫狀態(tài)緊密相關(guān)。最近研究顯示DC能夠識(shí)別和轉(zhuǎn)化真菌相關(guān)分子標(biāo)記，調(diào)控炎癥反應(yīng)，在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用[6-8]。還有研究認(rèn)為人源性DC對(duì)不同感染部位來源的孢子絲菌屬菌種樣本會(huì)產(chǎn)生不同的細(xì)胞反應(yīng)，尤其是感染內(nèi)臟和皮膚的菌種，皮膚感染的孢子絲菌刺激未成熟的DC比內(nèi)臟感染孢子絲菌刺激DC更能激活Th1反應(yīng)[9]。但是目前關(guān)于孢子絲菌屬菌種引起的感染與易感宿主的DC免疫反應(yīng)研究為數(shù)不多。本研究旨在初步探討宿主感染球形孢子絲菌(S.globosa)后的免疫應(yīng)答表現(xiàn)，為此本研究采用ELISA的方法檢測(cè)該菌刺激小鼠DC后能否誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、IFN-γ，為全面認(rèn)識(shí)和探索該菌與宿主的免疫應(yīng)答作用及促炎機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠骨髓源性DC由上海巴斯德研究天然免疫組贈(zèng)送。實(shí)驗(yàn)真菌菌株：新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科真菌實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)真菌菌種庫(kù)收集。各種炎癥因子ELISA試劑盒均購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)試劑：RPMI1640( Gibco，11875-093)，烏拉圭胎牛血清( Hyclone， SH30070.03)， pen/ strep( Hyclone，25)，其他試劑：PBS(Gibco，c20012500bt，PH7.2)，0.25%胰酶(Gibco，25200-056，100mL)，DMSO(Sigma，v90090)等。

1.2 真菌培養(yǎng)及菌懸液配置

將球形孢子絲菌轉(zhuǎn)種在PDA培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)1周，挑取培養(yǎng)好的菌落研磨，洗滌，過濾，離心，收集菌液，血球細(xì)胞板計(jì)數(shù)，最后用 PBS液將孢子懸液濃度分別稀釋至1×104個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×106個(gè)/mL、1×107個(gè)/mL備用。

1.3 DC培養(yǎng)及刺激

DC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃下含有5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)上述的細(xì)胞進(jìn)行1∶3傳代、完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至第9天收集懸浮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前收集DC細(xì)胞混懸液，以1000 r/min離心5 min。棄去上清液并重懸于3 mL含有10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養(yǎng)基中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞懸浮液濃度，最后將細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×106細(xì)胞/mL。鋪板：向6孔板的每個(gè)孔中加入1 mL上述的1×106細(xì)胞/mL濃度的DC懸液。再向每一孔中補(bǔ)充1 mL RMPI l640完全培養(yǎng)基，使6孔板每一孔中的總細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，培養(yǎng)液體積為2 mL。將鋪好的6孔板放入5%CO2培養(yǎng)箱中靜置12 h。6孔板從培養(yǎng)箱中取出，更換新鮮完全培養(yǎng)基(2 mL)后，分別加入1 mLPBS陰性對(duì)照，1 mL LPS陽(yáng)性對(duì)照(1 ng/mL)和1 mL不同濃度(1×104個(gè)/mL～1×107個(gè)/mL)的球形孢子絲菌孢子懸液，密封，再次放入CO2培養(yǎng)箱中。分別在6 h、24 h、48 h和72 h收集6孔板中的培養(yǎng)液。將收集的細(xì)胞和培養(yǎng)基放入EP管中，以1000 r/min的速度離心5 min，棄去沉淀物，收集上清液，直接用于ELISA測(cè)定。

1.4 IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ濃度的測(cè)定

DC經(jīng)過上述處理后，取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，具體方法按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)中用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個(gè)/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，分別在6 h、24 h、48 h、72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA法測(cè)IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α和IFN-γ的含量。同時(shí)以球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個(gè)/mL～1×107個(gè)/mL)劑量依賴性方式刺激DC后檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 球形孢子絲菌能夠誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α，但未產(chǎn)生IFN-γ和IL-4

用PBS、LPS(1 ng/mL)和球形孢子絲菌孢子懸液(1×104個(gè)/mL)刺激DC(1×106CFU/mL)，發(fā)現(xiàn)球形孢子絲菌能夠能誘導(dǎo)DC以時(shí)間依賴方式產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。不同時(shí)間點(diǎn)分泌量分別為：IL-1β(6 h：21.26±3.03；24 h：24.04±4.25；48 h：24.90±4.31；72 h：27.29±6.09)、IL-6(6 h：44.38±3.73；24 h：101.72±12.28；48 h：133.10±8.67；72 h：180.38±13.84)、TNF-α(6 h：860.36±20.64；24 h：356.03±11.46；48 h：457.43±17.39；72 h：1454.53±19.46)。由圖1可以看出，LPS和S.globosa菌液刺激DC 6 h后即可檢測(cè)到IL-1β，LPS組產(chǎn)生IL-1β的量均高于S.globosa組。在S.globosa組中隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)IL-1β的產(chǎn)量逐漸增加，刺激72 h時(shí)產(chǎn)生的量達(dá)到高峰，但在LPS刺激的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)IL-1β的量隨刺激時(shí)間長(zhǎng)短而顯著變化的現(xiàn)象。PBS組未檢測(cè)到IL-1β。IL-6的分泌也顯示了相同的表達(dá)規(guī)律(見圖2)。由圖3可見S.globosa組TNF-α的分泌量呈現(xiàn)不規(guī)則表達(dá)，在初始刺激6 h內(nèi)分泌量達(dá)到較高水平，刺激24 h分泌量反而迅速減少，之后又逐步增加，在72 h時(shí)分泌量達(dá)到高峰。LPS組的分泌量則較平穩(wěn)。另外結(jié)合圖1～3還可觀察到在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)3種細(xì)胞因子表達(dá)的量TNF-α > IL-6 > IL-1β。

2.2 球形孢子絲菌以劑量依賴性方式誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α

球形孢子絲菌能以劑量依賴和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。由圖4，5可以看出，隨著S.globosa菌液濃度劑量的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-1β、IL-6分泌量也逐漸增加。但低劑量的104個(gè)/mLS.globosa產(chǎn)生IL-1β的量未隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化。107個(gè)/mLS.globosa在6 h時(shí)產(chǎn)生IL-1β的量就明顯高于其他劑量組，并在72 h達(dá)到高峰。IL-6的表達(dá)量始終高于IL-1β(見圖4,5)。但105個(gè)/mLS.globosa濃度在72 h時(shí)分泌的IL-6的量未增加反而減少(見圖5)。TNF-α的表達(dá)量卻呈現(xiàn)不規(guī)則(見圖6)，S.globosa不同濃度劑量均在刺激6 h釋放出較高水平的TNF-α，但在刺激24 h卻急劇下降，48 h逐步增加，72 h達(dá)到高峰。

圖1球形孢子絲菌處理DC后在不同時(shí)間對(duì)產(chǎn)生IL-1β量的影響圖2球形孢子絲菌處理DC后在不同時(shí)間對(duì)產(chǎn)生IL-6量的影響圖3球形孢子絲菌處理DC后在不同時(shí)間對(duì)產(chǎn)生TNF-α量的影響圖4不同時(shí)間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生IL-1β含量圖5不同時(shí)間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生IL-6含量圖6不同時(shí)間段內(nèi)不同濃度劑量S.globosa刺激DC產(chǎn)生TNF-α含量

Fig.1Effect on the IL-1β production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.2Effect on the IL-6 production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.3Effect on the TNF-α production at different times afterS.globosastimulates DC cellsFig.4Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-1β in different time periodsFig.5Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing IL-6 in different time periodsFig.6Different concentrations ofS.globosastimulated DC producing TNF-α in different time periods

3 討 論

孢子絲菌病在全球均有發(fā)生，主要分布在熱帶和亞熱帶地域，南美洲最常見，日本和北美洲也是流行地區(qū)[10-15]。我國(guó)的長(zhǎng)江中下游流域、東北、新疆均有感染的患者。球形孢子絲菌是引起我國(guó)孢子絲菌病的主要致病菌種[16-17]。

研究表明，孢子絲菌病的嚴(yán)重程度隨宿主免疫狀態(tài)而變化。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在對(duì)抗感染中起核心作用[18-23]。然而控制感染的宿主免疫反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。Amanda 等[23]研究顯示NLRP3炎癥小體能夠識(shí)別S.schenckii，在孢子絲菌感染中具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與釋放的IL-1β和IL-17有關(guān)。

近年來DC在真菌感染中的作用開始受到醫(yī)學(xué)家的深入研究，盡管DC與孢子絲菌屬菌種互相作用的機(jī)制了解甚少[24]。DC是一類重要的天然免疫細(xì)胞和專職抗原呈遞細(xì)胞，在激活機(jī)體抗病原體免疫應(yīng)答及維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。DC的體內(nèi)遷移對(duì)于其成熟活化及功能調(diào)控至關(guān)重要。有研究表明，DC能夠識(shí)別提呈的孢子絲菌抗原，并誘導(dǎo)Th1/Th17免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IL-6，IFN-γ，IL-17，TGF-β和IL-23[25]。但是DC遷移紊亂可導(dǎo)致DC在炎癥部位的過度聚集及活化，導(dǎo)致組織過度炎癥，甚至引發(fā)炎癥性疾病的發(fā)生。因此DC在調(diào)節(jié)增強(qiáng)和減弱細(xì)胞免疫的促炎和抗炎反應(yīng)之間的平衡起著關(guān)鍵作用。

DC釋放的細(xì)胞因子能通過不同途徑啟動(dòng)細(xì)胞免疫，每個(gè)信號(hào)途徑又通過不同的細(xì)胞因子和效應(yīng)細(xì)胞互相調(diào)控特定的免疫反應(yīng)，最典型的途徑是Th1和Th2，近幾年又報(bào)道了新的Th17途徑[26]。還有研究用白念珠菌細(xì)胞表面的磷脂甘露聚糖PLM刺激DC及巨噬細(xì)胞通過TLR2產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-10[27]。DC成熟的標(biāo)志是顯著的表型和功能性轉(zhuǎn)化，包括對(duì)抗原呈遞能力的下降，細(xì)胞膜表面的MHC-Ⅱ和共同刺激分子表達(dá)增加以及細(xì)胞因子的分泌。我們的結(jié)果顯示用最低劑量的S.globosa菌液就能誘導(dǎo)激活DC釋放IL-1β、IL-6和TNF-α，我們的研究結(jié)果與Verdan等[25]刺激申克孢子絲菌結(jié)果相一致。其中IL-1β和IL-6分泌量隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)規(guī)律的表達(dá)，但是TNF-α分泌水平呈現(xiàn)不規(guī)律的表達(dá)。最終細(xì)胞因子分泌的量是TNF-α > IL-6 > IL-1β。另外我們的研究結(jié)果還顯示球形孢子絲菌能以劑量依賴和時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)DC分泌IL-1β、IL-6。以上研究結(jié)果充分說明，DC能夠識(shí)別球形孢子絲菌及其抗原，并在體外促進(jìn)Th1的分化，其分泌的炎癥因子可能在對(duì)抗真菌感染中起重要作用。在這里，不同濃度劑量的S.globosa菌液刺激DC分泌的TNF-α都呈現(xiàn)不規(guī)律表達(dá)，我們?cè)诔饬速|(zhì)量控制誤差的情況下，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因需要進(jìn)一步研究。另外本研究未檢測(cè)到IL-4和IFN-γ，傳統(tǒng)認(rèn)為，產(chǎn)生IFN-γ的Th1細(xì)胞反應(yīng)是對(duì)真菌感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)，而由IL-4介導(dǎo)的Th2反應(yīng)則導(dǎo)致對(duì)真菌感染的易感性增加，在Verdan[25]的研究中同樣未檢測(cè)到Th2路徑分泌的IL-4和IL-5。因此提示DC在孢子絲菌屬菌種感染早期和感染過程中主要發(fā)揮的是天然免疫應(yīng)答，獲得性免疫應(yīng)答在感染發(fā)展過程中逐漸形成。