吳楠，王濤，馬劍雄，呂工一，馬信龍

（1.天津醫(yī)院 脊柱外科，天津 300211；2.天津市中西醫(yī)結合骨科研究所，天津 300050；3.天津醫(yī)院 骨外科，天津 300211）

脊髓損傷是臨床上一種較為常見的運動系統(tǒng)創(chuàng)傷，對患者的中樞神經(jīng)產(chǎn)生損害，導致患者發(fā)生不同程度的肢體癱瘓或者喪失勞動能力。近年來脊髓損傷的發(fā)生率逐年提高[1]。脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷為不可逆的損傷，繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷發(fā)生后逐漸形成的損傷，伴隨著自由基損傷、炎癥反應、細胞凋亡等基因表達和細胞代謝的改變，繼發(fā)性損傷對人體產(chǎn)生的危害甚至會大于原發(fā)性損傷[2]。有研究表明[3]，脊髓損傷發(fā)生后體內基因的改變參與病理變化過程。microRNA（miRNA）屬于生物體內較短的非編碼單鏈小分子RNA，生物信息預測miRNA可至少對人類30%的蛋白質編碼基因的表達進行調控，miRNA的發(fā)現(xiàn)為臨床上多種疾病的治療及機制研究提供了新的方向。研究顯示[4]miRNA可通過調控信號轉導和轉錄激活子3（STAT3）通路，參與多種疾病的調控，其中STAT3屬于JAK-STAT信號通路中的核轉錄因子，當其被激活變?yōu)榱姿峄疭TAT3（p-STAT3）后，一方面參與細胞的增殖、凋亡過程，另一方面可對免疫進行調節(jié)，在脊髓損傷疾病的發(fā)生、發(fā)展中有較重要的作用。目前對miR-136-5p靶向STAT3調控對脊髓損傷大鼠炎癥因子的影響研究較少，本文就該課題進行研究，為臨床上脊髓損傷的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取60只SD健康大鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，月齡3～6個月，平均（4.2±0.5）個月，體重 200～250 g，平均（224.6±6.5）g。所有大鼠養(yǎng)殖于干凈籠子里，室溫（22.1±1.8）℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間為1周。本實驗獲得天津醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

miRNA-136-5p載體購自北京合生基因科技有限公司，大鼠脊髓神經(jīng)元細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，小鼠抗大鼠白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素-21（IL-21）、白細胞介素-23（IL-23）、白細胞介素-17（IL-17）抗體購自北京義翹神州科技有限公司，兔抗小鼠STAT3、p-STAT3抗體購自深圳欣博盛生物科技有限公司，兔抗大鼠腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗體、HE 染色劑、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒載體構建 miR-136-5p 表達抑制的慢病毒載體構建及大鼠miR-136-5p的序列查找和設計由廣州易錦公司完成。重組的LV-miR-136-5p和LV-sponge（抑制載體）慢病毒表達載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測序驗證。行慢病毒滴度檢測，制備完成后重組慢病毒置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 分組及模型復制 將60 只大鼠按照完全隨機法分為對照組、脊髓損傷組、沉默組及過表達組，每組15只。脊髓損傷組、沉默組、過表達組大鼠復制脊髓損傷模型，對照組在模型復制期間不做任何處理。原發(fā)性脊髓損傷模型復制方法[5]：使用3%戊巴比妥鈉注射于大鼠腹腔做麻醉處理，劑量為30 mg/kg，暴露出大鼠T12～L1節(jié)段硬脊膜，在離大鼠脊髓10 cm高度處以自由落體方式使用5 g沖擊桿沿垂直沖擊通道對大鼠T13節(jié)段以下脊髓進行打擊，大鼠立刻出現(xiàn)尾巴、軀干痙攣性擺動及雙下肢回縮樣撲動，且大鼠蘇醒后出現(xiàn)弛緩性癱瘓、排尿功能障礙。模型復制成功后，將10 μl miR-136-5p慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml）在無菌環(huán)境下注射于沉默組、過表達組大鼠脊髓損傷區(qū)。對照組、脊髓損傷組大鼠注射等量的生理鹽水。

1.3.3 運動功能、脊髓神經(jīng)功能評價 使用 Beattie、Bresnahan、Basso（BBB）評分對4組大鼠運動功能進行評價，評定前排空大鼠膀胱，上午10：00由3位實驗人員通過雙盲法進行，取平均值。評價內容包括關節(jié)運動、運動協(xié)調、行走、軀干穩(wěn)定性，滿分21分，分數(shù)越高說明大鼠運動功能越正常，21分表示大鼠運動功能正常。使用聯(lián)合行為評分法（combined behavioral score,CBS）對4組大鼠脊髓神經(jīng)功能進行評價，評價內容包括大鼠運動功能分級、腳趾觸地反應能力分級、端正體位反射、回縮反應能力分級、伸展能力分級、游泳實驗、斜板實驗等，滿分為100分，分數(shù)越高說明大鼠脊髓神經(jīng)功能障礙越嚴重，100分表示大鼠后肢功能完全喪失，0分表示大鼠脊髓神經(jīng)功能正常。

1.3.4 組織切片及染色 4 組大鼠全身麻醉處理后，采用斷頭法處死，在無菌、低溫條件下取大鼠損傷節(jié)段脊髓組織，對照組大鼠取與其他3組大鼠相對應節(jié)段的脊髓組織，大鼠腎組織在4%多聚甲醛中浸泡、固定，4℃環(huán)境下保存，使用二甲苯進行常規(guī)脫蠟處理2次，5 min/次，然后在梯度酒精下脫水處理3 min，自來水沖洗1次；使用蘇木精染色5 min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中返藍處理2 min，自來水沖洗1次；0.5%濃度伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度脫水處理，常溫下使用15% EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm厚的組織切片，最后用中性樹膠進行封片，光學顯微鏡下觀察大鼠脊髓的病理改變。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測 IL-6、IL-21、IL-23表達水平 大鼠模型復制前和復制2 h后取股靜脈血2 ml，保存。將采集到的標本用50 mmol碳酸鹽包被緩沖液進行抗原溶解，濃度為10～20 μg/ml，按100 μl/孔加入96孔酶標板中，4℃過夜保存。第2天舍棄包被液，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，每孔中加入1%的BSA 150 μl，在37℃環(huán)境中封閉1 h。PBST洗滌3次，每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，顯色劑顯色20 min后，在酶標儀上讀取A405吸收值。

1.3.6 Western blotting檢測脊髓組織 STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量 將采集到的標本用PBS清洗3遍以上，分離PBS，加入IP細胞裂解液，裂解35 min，提取總蛋白，蛋白質定量（BCA法）檢測蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，通過10%的SDS-PAGE進行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V，電泳10 min，結束之后，將電轉膜浸泡在10%的牛奶中，37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結合，加入TBST稀釋，按1∶1 000稀釋一抗Tubuli（n內參照），4℃孵育過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復清洗。最后加入顯影劑將其浸在底物溶液中顯色，嚴格按照顯影定影試劑盒說明書進行操作。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶連反應檢測 IL-17 mRNA表達水平 在無菌環(huán)境下取大鼠脊髓組織，使用Trizol法提取組織RNA，總反應體系20 μl，42℃水浴60 min，70℃、5 min終止反應，逆轉錄合成第一鏈cDNA。取1 μl逆轉錄產(chǎn)物cDNA作為反應模板，總反應體系為20 μl，IL-7正向引物序列：5'-GTGTC TCTGATGCTGTTG-3'；反向引物序列：5'-AACGGTTG AGGTAGTCTG-3'，產(chǎn)物大小為452 bp。退火溫度為57℃，95℃預變性 5 min，60℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸 10 min。取 6 μl PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并采集圖片，用Image J軟件對圖像進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠運動功能、脊髓神經(jīng)功能評分比較

4組大鼠BBB評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過表達組大鼠BBB評分低于對照組（P＜0.05），沉默組大鼠BBB評分高于脊髓損傷組、過表達組（P＜0.05）；4組大鼠CBS評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過表達組大鼠CBS評分高于對照組（P＜0.05）；沉默組大鼠CBS評分低于脊髓損傷組、過表達組（P＜0.05）。見表1。

2.2 4組大鼠脊髓的病理組織學變化

對照組大鼠無脊髓損傷，神經(jīng)細胞形態(tài)正常，膠質細胞分布均勻；脊髓損傷組、沉默組、過表達組大鼠存在明顯的脊髓損傷，損傷部位結構喪失，僅有少量的神經(jīng)細胞數(shù)目，存在細胞浸潤；過表達組大鼠脊髓損傷較沉默組大鼠嚴重，神經(jīng)細胞形態(tài)異常，膠質細胞大量增生。見圖1。

表1 4組大鼠運動功能、脊髓神經(jīng)功能評分比較（n =15，±s）

表1 4組大鼠運動功能、脊髓神經(jīng)功能評分比較（n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 BBB評分 CBS評分對照組21.00±0.00 0.00±0.00脊髓損傷組2.67±0.25①② 89.65±3.56①②沉默組3.26±0.38① 65.32±1.67①過表達組2.01±0.12①② 95.68±4.62①②F值 13.827 6.006 P值 0.001 0.001

2.3 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平比較

4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過表達組大鼠脊髓組織中IL-6、IL-21、IL-23表達水平高于對照組（P＜0.05），沉默組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平低于脊髓損傷組、過表達組（P＜0.05）。見表2。

2.4 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA表達水平比較

4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），沉默組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA表達水平均低于對照組、脊髓損傷組及過表達組（P＜0.05）。見表3和圖2。

圖1 4組大鼠病理組織學切片圖（HE×200）

表2 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平比較 （n =15，pg/ml，±s）

表2 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平比較 （n =15，pg/ml，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 IL-6 IL-21 IL-23對照組78.26±2.28 53.21±2.31 20.02±1.65脊髓損傷組87.56±1.25①② 72.13±3.00①② 30.49±1.01①②沉默組80.12±3.16① 63.23±1.68① 22.16±2.06①過表達組95.38±4.67①② 75.89±4.12①② 40.26±3.28①②F值 19.138 27.895 32.025 P值 0.001 0.001 0.001

圖2 4組大鼠脊髓組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達水平

表3 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA 表達水平比較 （n =15，±s）

表3 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA 表達水平比較 （n =15，±s）

注 ：?與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 STAT3 p-STAT3 IL-17 mRNA對照組1.00±0.01? 1.00±0.05? 1.00±0.01?脊髓損傷組1.10±0.05? 1.21±0.07? 1.13±0.10?沉默組0.10±0.02 0.37±0.01 0.24±0.01過表達組1.23±0.16? 1.36±0.12? 1.35±0.12?F值 8.335 16.088 16.886 P值 0.001 0.001 0.001

3 討論

脊髓損傷發(fā)生后機體會出現(xiàn)原發(fā)性脊髓組織壞死、細胞溶解、繼發(fā)性損傷等，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，損傷面以下的運動感覺功能、括約肌功能完全喪失或者不完全喪失[6]?；颊呱窠?jīng)元會大量壞死、發(fā)生局部免疫炎癥反應及缺血性水腫，目前臨床上常手術聯(lián)合藥物治療此病，以減輕繼發(fā)性損傷，但療效均不理想，患者預后較差。

近年來隨著對miRNA生物學功能機制的不斷深入研究，在多種動植物、微生物中發(fā)現(xiàn)多達17 000個miRNA，和人類相關的miRNA包括1 000多種，為臨床多種疾病診斷、治療及預后提供新的方向[7-8]。有研究認為[9-11]，當機體處于正常生理條件下，miRNA能夠對正常免疫功能進行調節(jié)，當機體生理條件異常時，miRNA參與機體應激反應，miRNA表達出現(xiàn)異常，對紊亂的機體功能進行調節(jié)，通過一系列的作用，導致自身免疫性疾病的發(fā)生。有研究表明[12]，miRNA可參與機體細胞增殖、凋亡、免疫反應、炎癥反應等生理過程和疾病的發(fā)生過程。徐宏博等[13]認為miRNA與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病相關，包括帕金森綜合征、阿爾茲海默病等。miRNA是一類長19～25個核苷酸的非編碼RNA，通過靶向靶基因3'-非編碼區(qū)，進而對靶基因的表達進行抑制[14]。研究表明[15-16]，miRNA可通過靶向調控STAT3通路，對細胞炎癥反應、細胞增殖、凋亡進行調節(jié)。

STAT3屬于STAT家族成員，是一種轉錄因子，能夠調控基因的表達。STAT3位于染色體17q21區(qū)域，為DNA結合蛋白酶，能夠對表皮細胞生長因子的刺激產(chǎn)生反應。當STAT3磷酸化后會導致STAT3二聚化、易位至細胞核中，與DNA結合，參與機體的炎癥反應[17-18]。目前有研究報道[19]，Th17細胞分化與IL-6、IL-21、IL-23相關，可在絲氨酸激酶或者YAK的誘導下轉化為p-STAT3，之后形成二聚體并進入至細胞核，和IL-17的啟動子相結合，對其進行調節(jié)、轉錄，最終促進Th17細胞的分化。有研究表明[20]，STAT3的過度表達與Th17細胞的分化相關。本研究中，對4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平及STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA表達水平進行檢測，結果顯示，沉默組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達水平及STAT3、p-STAT3蛋白相對表達量、IL-17 mRNA表達水平均低于過表達組大鼠，該結果提示miR-136-5p可通過靶向STAT3，抑制STAT3磷酸化，作用于Th17細胞，對Th17細胞炎癥因子水平進行調控，進而抑制炎癥反應。

綜上所述，脊髓損傷后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表達，進而抑制炎癥因子的過度表達，最終抑制脊髓炎癥反應。

目前關于對miR-136-5p靶向調控STAT3的研究尚未有報道，本文研究了miR-136-5p靶向STAT3調控對脊髓損傷大鼠炎癥因子的影響，為臨床上脊髓損傷的研究提供了新的方向。