王姍姍，趙佳惠，張訓(xùn)樂，丁 郁，張 洋，郭小燕，薛文達，黃家情，聞 嫵，陳 剛，貢岳松*

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其病理特征為β淀粉樣蛋白異常沉積形成斑塊，tau蛋白過度磷酸化形成纏結(jié)的神經(jīng)纖維以及炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元及突觸體丟失[1]。腦內(nèi)胰島素信號通路障礙可誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶功能下降、Aβ沉積、tau過度磷酸化、突觸功能異常等[2-3]。

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)在外周破壞B細胞導(dǎo)致胰島素抵抗，誘導(dǎo)糖尿病癥狀，在中樞可以使認(rèn)知記憶相關(guān)的腦區(qū)胰島素受體表達下降，導(dǎo)致認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)記憶損傷、神經(jīng)元丟失等散發(fā)性AD樣病變[4-6]。所以，側(cè)腦室注射STZ被用于制造AD樣損傷模型[7]。

神經(jīng)突觸的丟失是AD記憶損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[8-9]。突觸后膜致密區(qū)(PSD)對維持正常神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能以及學(xué)習(xí)記憶至關(guān)重要。PSD95是PSD結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白[10]，敲除PSD95小鼠會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[11]。此外，刺激谷氨酸受體NMDAR和由此產(chǎn)生一氧化氮(NO)的高效生成連接PSD95來調(diào)節(jié)恐懼記憶[12]。Shank3是PSD結(jié)構(gòu)的支架蛋白，在突觸結(jié)構(gòu)的維持中起著核心作用[13-14]，而PSD95和Shank3蛋白在AD中明顯缺失[15-16]，可能直接影響突觸功能、學(xué)習(xí)記憶和恐懼記憶[17-18]。目前，治療AD的藥物乙酰膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑都無法改善AD的發(fā)病進程[19-20]。

越鞠丸記載于元代朱丹溪的《丹溪心法》，由蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子五味藥組成。越鞠丸重在理氣解郁，兼顧六郁(汪昂《醫(yī)方集解》)。實驗表明，越鞠丸可以改善記憶障礙，并且顯著上調(diào)帕金森病抑郁模型小鼠前額皮層突觸可塑性相關(guān)蛋白水平，增強突觸可塑性[21-22]。

本實驗采用側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(ICV-STZ)建立AD小鼠模型，探討越鞠丸對其學(xué)習(xí)記憶損傷以及恐懼記憶的改善作用及對大腦皮層PSD95和Shank3蛋白表達的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性ICR小鼠，體重28～30 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司南京分公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2016-0003。

1.2 藥物與試劑 STZ(美國Sigma公司，批號：160901)，越鞠丸(購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部，批號：160901，將藥丸用粉碎機粉碎，按0.2 kg/L與生理鹽水充分混合后，超聲1 h，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，PSD95(美國CST，批號：3450)，Shank3(SANTA CRUZ，批號：sc-30193)及β-actin(美國CST，批號：3700)，二抗Goat Anti-Mouse、Goat Anti-Rabbit(博士德生物公司，批號：BA1050、BA1054)，蛋白定量BCA試劑盒(上海碧云天生物研究所，批號：P0010)，超敏ECL發(fā)光液試劑盒(上海天能科技有限公司，批號：180-5001)。

1.3 儀器 SLY-WMS型的Morris水迷宮(北京市碩林苑科技有限責(zé)任公司)、多功能水平電泳槽(天能HE-120)、電泳儀(天能EPS-300)、轉(zhuǎn)移電泳槽(天能VE-186)、垂直電泳槽(天能VE-180B)、純水超純水系統(tǒng)(Elix ESSENTIAL 3/SYNERGY，賽飛中國有限公司)、超聲波細胞粉碎儀(Biosafer900-92，賽飛中國有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)、條件恐懼系統(tǒng)(Coulbourn恐懼條件系統(tǒng)，武漢普百康科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 側(cè)腦室注射STZ誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)以及損傷模型的建立及越鞠丸給藥 將小鼠隨機分為4組：正常對照組(Control)、假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)和越鞠丸治療組(Yueju)。側(cè)腦室注射，注射位點位于兩眼連線中點垂直向后2 mm，垂直中線旁開1.5 mm，垂直顱骨進針2.5 mm。造模完成后越鞠丸治療組給予越鞠丸[2.0 g/(kg·d)]灌胃治療，其余組給予相同體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥6周[23]。

2.2 血糖值測定 每周對小鼠禁食不禁水1次，通過尾靜脈采血，用三諾血糖儀測定血糖值。

2.3 Morris水迷宮試驗 小鼠給藥6周后，所有小鼠進行Morris水迷宮實驗。此實驗歷時5 d，前4 d是訓(xùn)練期，每只小鼠每天訓(xùn)練4次。每次從不同的標(biāo)記處入水，將小鼠面向池壁放入，記錄60 s。若60 s內(nèi)未能找到平臺，則用細竹竿引導(dǎo)至平臺，并讓小鼠在平臺上待15 s，每次從平臺上拿出的小鼠放入空鼠籠中。第5天實驗期，每只小鼠只放入池中1次，每只隨機抽取標(biāo)記點放入，記錄60 s內(nèi)尋找平臺所需時間(逃避潛伏期)。若小鼠入水后60 s內(nèi)未能找到平臺，逃避潛伏期記錄為60 s，數(shù)據(jù)采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視系統(tǒng)處理。

2.4 條件恐懼實驗 Morris水迷宮實驗結(jié)束后，進行條件恐懼實驗。整個實驗歷時3 d，第1天是條件訓(xùn)練期(聲音刺激加點刺激)，設(shè)定的程序如下：小鼠放入實驗箱后，首先是3 min的適應(yīng)期，讓小鼠在實驗箱內(nèi)自由活動。適應(yīng)期結(jié)束后為聲音刺激(Tone音，2.5 Hz，85 dB)，持續(xù)刺激30 s，聲音刺激結(jié)束后緊跟電刺激(0.75 mA)，持續(xù)2 s，然后中間空白2 min，即無聲音刺激和電刺激。以上聲音刺激-電刺激-無任何刺激過程重復(fù)6次(共7次，時長1 244 s)。實驗過程中軟件會自動采集并記錄小鼠活動度等情況。24 h后進行Contextual期，將小鼠放入實驗箱中，無聲音刺激和電刺激，讓其自由活動，時長1 200 s。第3天進行記憶測試(聲音刺激)，實驗箱中環(huán)境做出改變，柵欄上和對角線加上紙板保證實驗箱中內(nèi)環(huán)境與前2 d不一樣。設(shè)置測試條件：恐懼箱內(nèi)室燈開啟，小鼠自由活動并適應(yīng)3 min，聲音刺激(Tone音，2.5 Hz，85 dB)持續(xù)刺激30 s后中間停止2 min，不給予任何刺激，2 min后再次給予聲音刺激，即聲音刺激30 s-無刺激，整個過程重復(fù)9次，整個實驗一共10次，總時長為1 680 s。在整個實驗過程中要保證外部環(huán)境安靜，在隔絕外界干擾噪音的情況下進行操作。

2.5 蛋白免疫印跡試驗檢測突觸相關(guān)蛋白 條件恐懼實驗結(jié)束后，頸椎離斷處死各組小鼠，在冰上快速取腦，放入-80 ℃冰箱中凍存。取出凍存的皮層組織，加入1% SDS、PMSF及磷酸酶抑制劑，用超聲波破碎儀進行破碎裂解(功率為360 W，超聲時間2 s，間隙時間3 s，持續(xù)2 min)，裂解后的組織于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，用BCA法測蛋白濃度以制備樣品。SDS-PAGE電泳，NC膜濕轉(zhuǎn)，5%牛奶封閉，室溫1 h。加入稀釋好的一抗(1∶2 000)，4 ℃過夜。洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10 000)室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光顯色；掃描儀掃描電泳條帶，Image J軟件進行結(jié)果條帶的處理和分析。

3 結(jié)果

3.1 越鞠丸對小鼠空腹血糖的影響 側(cè)腦室注射STZ小鼠空腹血糖注射前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻報道一致[24-25]，表明側(cè)腦室注射STZ對機體血糖水平無明顯影響。灌胃越鞠丸不改變小鼠血糖水平。見圖1。

圖1 灌胃越鞠丸后各組血糖水平

3.2 越鞠丸對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 前4 d訓(xùn)練過程中，各組的平均潛伏期日漸縮短。訓(xùn)練至第3天開始，與正常對照組相比，模型組的平均潛伏期明顯延長(P<0.05)，說明模型成功。而越鞠丸治療組與模型組相比潛伏期明顯縮短(P<0.05)，說明給予越鞠丸后小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力得到改善。見圖2。

圖2 越鞠丸對側(cè)腦室注射STZ小鼠模型學(xué)習(xí)記憶的影響

注：A.小鼠在訓(xùn)練和測試試驗期間的學(xué)習(xí)記憶情況；B.小鼠在空間探索實驗中找到平臺的時間。與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01；與Sham組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 越鞠丸對小鼠恐懼記憶的影響 條件恐懼系統(tǒng)實驗結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射STZ可以降低小鼠僵直時間百分比，即小鼠恐懼記憶異常降低，而給予越鞠丸可以增加其僵直時間百分比(P<0.05)，提示越鞠丸可以改善側(cè)腦室注射STZ導(dǎo)致的恐懼記憶異常。見圖3。

圖3 越鞠丸對側(cè)腦室注射STZ小鼠模型恐懼記憶的影響

3.4 越鞠丸對小鼠皮層組織突觸蛋白PSD95和Shank3的影響 Western blot檢測小鼠大腦皮層PSD95和shank3的表達。采用特異性抗體檢測小鼠大腦皮層組織PSD95和Shank3的表達，與內(nèi)參相比，模型組小鼠皮層組織中PSD95和Shank3均低于正常對照組(P<0.05)，長期給予越鞠丸改善了STZ引起的PSD95和Shank3蛋白水平的降低。見圖4。

4 討論

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)用于治療AD的藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑(他克林、利伐斯的、加蘭他敏、多奈哌齊)和NMDA受體拮抗劑(美金剛)。美金剛是FDA唯一批準(zhǔn)用于中重度AD的藥物，可以保護神經(jīng)元，防止NMDA受體介導(dǎo)的過度興奮性毒性對其造成損傷[20]，然而，美金剛無法改善AD的發(fā)病進程，且無法治愈AD[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，越鞠丸對小鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷有明顯的改善作用，還可以調(diào)節(jié)恐懼記憶，以及保護突觸蛋白PSD95和Shank3，從而對AD癥狀有良好的改善作用。

圖4 Western blot檢測小鼠皮層PSD95和Shank3蛋白的表達水平

STZ是亞硝基脲類衍生物，在外周可以選擇性破壞胰島細胞導(dǎo)致糖尿??；在中樞可引起胰島素受體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致腦葡萄糖代謝異常和能量生成減少。另外，腦室注射STZ還可導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ表達增加[26]，影響突觸的結(jié)構(gòu)和功能蛋白的表達，降低PSD95和Shank蛋白水平[25]。PSD95是PSD結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白，是決定興奮性突觸結(jié)構(gòu)和功能完整性的主要支架蛋白，是神經(jīng)發(fā)育過程中參與谷氨酸能傳遞、突觸可塑性和樹突狀脊柱形態(tài)形成的重要成分[10]。PSD95在發(fā)育過程中的功能障礙可能會改變樹突棘上的突觸可塑性，而突觸可塑性異常使學(xué)習(xí)記憶功能障礙導(dǎo)致AD的發(fā)生。研究報道，敲除PSD95小鼠會表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)記憶障礙和長時程增強[11]。Shank3是PSD結(jié)構(gòu)的支架蛋白，促進興奮性突觸的形成和樹突棘的發(fā)育，在突觸結(jié)構(gòu)的維持中起著核心作用[13-14]。PSD95和Shank3表達下降會導(dǎo)致突觸功能異常，而突觸功能異常與AD患者臨床認(rèn)知功能下降最為相關(guān)，是記憶早期損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸丟失與癡呆嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8-9]。因此，側(cè)腦室注射STZ影響突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和突觸可塑性，造成記憶丟失，引起小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷等AD樣神經(jīng)退行性改變[27]。

恐懼記憶與抑郁的關(guān)系密切相關(guān)，研究表明，壓力、應(yīng)激障礙等會增強恐懼記憶反射增強，而這些因素會提高抑郁癥的發(fā)病風(fēng)險。氯胺酮作為經(jīng)典的抗抑郁藥物，可以加速恐懼記憶的消退[28]。越鞠丸在快速抗抑郁方面有很好的療效，同時也可以改善記憶障礙，上調(diào)突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達水平，增強突觸可塑性。而正常的突觸功能以及突觸可塑性與記憶功能關(guān)系密切。

本實驗小鼠側(cè)腦室注射STZ后，小鼠血糖沒有發(fā)生變化，但在Morris水迷宮試驗中，小鼠找到水下平臺所需時間與假手術(shù)組相比明顯延長，說明側(cè)腦室注射STZ可直接誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙且不引起血糖變化。給予越鞠丸后小鼠潛伏期明顯縮短，提示越鞠丸對側(cè)腦室注射STZ所致的記憶損傷小鼠模型具有一定的保護作用。Western blot結(jié)果顯示，ICV-STZ小鼠大腦皮層內(nèi)PSD95、Shank3蛋白水平降低，與文獻一致[25,29]。給予越鞠丸后PSD95、Shank3蛋白水平增加并接近假手術(shù)組。此外，側(cè)腦室注射STZ導(dǎo)致恐懼記憶異常下降，而越鞠丸可以改善其異常。

綜上所述，STZ側(cè)腦室注射導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，越鞠丸灌胃可以明顯減輕ICV-STZ對小鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷，對恐懼記憶的異常也有明顯的調(diào)節(jié)作用，其機制可能與增加小鼠大腦皮層組織PSD95、Shank3蛋白水平以及保護突觸功能相關(guān)。本研究為越鞠丸用于AD防治的后續(xù)研究提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)，但是具體的作用機制尚不清楚，有待進一步探究。