段素琴,楊亞平,楊鳳梅,李艷艷,劉 權(quán),趙 遠(yuǎn),馬紹輝,和占龍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650118)

近年來(lái),手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)在亞太地區(qū)呈持續(xù)高發(fā)態(tài)勢(shì),中國(guó)大陸每年發(fā)病數(shù)超百萬(wàn)人,死亡近千人,已成為重要的公共衛(wèi) 生 問(wèn) 題[1]。 HFMD 主 要 是 由 腸 病 毒 71(Enterovirus 71,EV-71)、柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16,CA16)和柯薩奇病毒A6(Coxsackie virus A6,CA6)引起的,但自2008 年以來(lái),其他的柯薩奇病毒例如CV-B2、CV-B1 和CV-B4 等在手足口病人也經(jīng)常被檢測(cè)并報(bào)道[2-3]。

人類柯薩奇B2 病毒(Coxsackie virus B2,CVB2),是一類無(wú)包膜,單股正鏈RNA 病毒,隸屬人類腸道病毒B 組。 該病毒感染后可能會(huì)發(fā)生HFMD、心肌炎、克山病和無(wú)菌的腦膜炎等疾病,特別是小于1 歲的嬰幼兒由于免疫功能相對(duì)不足,感染后病癥較為嚴(yán)重[4-6]。 據(jù)報(bào)道,我國(guó)早在1995 年山東就爆發(fā)了CV-B2 導(dǎo)致的病毒性腦膜炎的流行,在各省都有流行的相關(guān)的報(bào)道,并且臺(tái)灣省于1999、2002、2003 和2006 年CV-B2 的感染率均異常增高[7-8]。

據(jù)報(bào)道CV-B2 可以引發(fā)致命的心肌炎,但到目前為止針對(duì)CV-B2 病毒疫苗和藥物的研究和相關(guān)的動(dòng)物模型未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道,尤其是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型[9]。 本研究旨在選擇與人最為接近的非人靈長(zhǎng)類恒河猴嬰猴作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行人類柯薩奇B2病毒嬰猴感染模型的初步研究,為進(jìn)一步研究該病毒引起HFMD 的發(fā)病機(jī)制、病理生理、藥物和疫苗的研發(fā)及評(píng)價(jià)等方面提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取普通級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、背景清晰、3 ～4 月齡,雄性5只恒河猴嬰猴,編號(hào)分別為18001、18003、18005、18007、18009,實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行CV-B2 病毒中和抗體檢測(cè)均為陰性,體重0.6 ～0.7 kg(誤差不大于10%),來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長(zhǎng)類中心[SCXK(滇)K2015-0004];動(dòng)物飼養(yǎng)于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SYXK(滇)K2015-0006],光照12 h/d,溫度26℃～29℃,濕度40%～60%。 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物單籠隔離飼養(yǎng)適應(yīng)兩周,每天飼喂4 餐,牛奶和蒸糕為主,輔助適量水果,自由飲水。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批號(hào)：DWSP201810002),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)期間按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

CV-B2(RW41-2/YN/CHN/2012)保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室。

Takara PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(日本);Tiangen 2 × Taq PCR Mastermix(中國(guó));瓊脂糖(西班牙);Vivacell EcoDye DNA 染料核酸染料(美國(guó))。

Sysmex XT-2000i 血細(xì)胞儀(日本希森美康);Mindray BS-2000 自動(dòng)生化分析儀(中國(guó)邁瑞);Motic 顯微鏡及成像系統(tǒng)(中國(guó));BioTeK 酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè));Thermo 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)); Bio-Rad PCR system(美國(guó));立式高壓滅菌鍋(SX-500,日本Tomy 公司);制冰機(jī)(IMS-200,常熟雪科);海爾冰箱(BCD- 215KMLM);醫(yī)用低溫保存箱(DW -25L262,海爾);移液槍(Eppendorf,德國(guó));槍頭(Axygen,美國(guó));1.5 mL 離心管(Axygen,美國(guó));福爾馬林(茂業(yè)試劑,中國(guó));止血干棉花(中國(guó));手術(shù)器械(中國(guó));肛式體溫計(jì)(中國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物感染及樣本采集

(1)結(jié)合人的腸道病毒的主要感染途徑,參考Chen 等[10]的EV71 建模方式,按照每只動(dòng)物經(jīng)口腔感染滴定毒株106TCID50/mL 的CV-B2。

(2)樣本采集：于感染后第0、1、2、3、4、5、7、11、14 天采集后肢靜脈血,抗凝血1 mL、非抗凝血2 mL。 采集感染后第3 天的皰疹組織浸泡于10%福爾馬林進(jìn)行固定,并用無(wú)菌棉簽蘸取皰疹液保存于-80℃冰箱中。

1.3.2 臨床觀察和記錄

(1)第0 ～14 天,每天觀察3 次動(dòng)物臨床癥狀,包括飲食量、活動(dòng)度、精神狀態(tài)、皰疹、排便情況等,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分記錄：正常-0;精神萎靡-1;弓背沉郁-2;活動(dòng)減少-3;消瘦-4;四肢麻痹-5;瀕死或死亡-6;飲食量減少-7;皰疹-8。

(2)第0～14 天,每天早晨9：00 測(cè)量肛拭體溫。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

(一)血細(xì)胞檢測(cè)和生化檢測(cè)

取抗凝血150 μL,按照操作說(shuō)明測(cè)定血細(xì)胞。非抗凝血標(biāo)本在4℃靜置半小時(shí),待血清自然析出(無(wú)溶血現(xiàn)象),4℃,4000 r/min,離心10 min,輕輕吸出血清至1.5 mL 離心管中,及時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行生化指標(biāo)(肝功、腎功、心肌酶)的檢測(cè)。

(二)血液和皰疹PCR 的鑒定

1.針對(duì)CV-B2(RW41-2/YN/CHN/2012)選擇保守序列作為靶基因,通過(guò)Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兩組巢式PCR 的引物(見(jiàn)表1),引物昆明碩勤技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.用TRIzol 法提取感染后的皰疹液和血液的RNA,以提取的RNA 作為模板,通過(guò)巢式PCR 對(duì)血液和皰疹液中的病毒情況進(jìn)行檢測(cè)。 首先,用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進(jìn)行RT-PCR,反應(yīng)體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL,2 × 1 Step Buffer 10 μL,RNA 模板2 μL,F1 1 μL,R1 1 μL,ddH2O 5 μL。 反應(yīng)條件為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min,94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,34個(gè)循環(huán)后再72℃延伸7 min。 其次,進(jìn)行二次PCR,反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL,F2 1 μL,R2 1 μL,RT-PCR 產(chǎn)物2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min,94℃ 變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸40 s,34 個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5 min。 最后,取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)DNA marker (DL 2000,TaKaRa)、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照判定結(jié)果,用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶大小并拍照。 PCR 陽(yáng)性擴(kuò)增片段送昆明碩勤測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)與Genbank 中CV-B2 序列(RW41-2/YN/CHN/2012)進(jìn)行比對(duì)以確定PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

(三)組織病理將固定好的皰疹組織及時(shí)送昆明金裕醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行制片, HE 染色(hematoxylin-eosin staining),病理結(jié)果利用全自動(dòng)病理圖文系統(tǒng)進(jìn)行掃描觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對(duì)數(shù)據(jù)計(jì)算均值,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮實(shí)驗(yàn)猴的倫理及研究成本等因素,設(shè)計(jì)為實(shí)驗(yàn)前后對(duì)照方案,動(dòng)物的體溫、血細(xì)胞、生化檢測(cè)指標(biāo)均采取實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

經(jīng)口腔方式(消化道)感染恒河猴嬰猴后出現(xiàn)體溫升高,手、足、口、生殖器等部位出現(xiàn)皰疹,血象、心肌酶、肝功能和腎功能的改變,結(jié)合RT-PCR和病理結(jié)果可以確定恒河猴嬰猴感染CV-B2 后出現(xiàn)了典型的手足口病的癥狀。

2.1 臨床觀察記錄

恒河猴嬰猴感染CV-B2 后,每天對(duì)其進(jìn)行臨床癥狀觀察,體溫呈現(xiàn)不規(guī)則熱型,低熱(38℃～39℃之間),感染第2、7、14 天略有上升(見(jiàn)圖1);在感染初期并沒(méi)有發(fā)生明顯的起伏變化,排便均正常。 在感染第2 天起5 只實(shí)驗(yàn)猴均出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神低迷、飲食量減少等現(xiàn)象,未出現(xiàn)四肢麻痹和死亡;在感染第2 天開始,每只猴子均在不同時(shí)間點(diǎn)、不同部位出現(xiàn)手、足、口部皰疹,所有猴子咽部均出現(xiàn)約2～3 mm 大小的灰白色皰疹,周圍有紅暈,伴有充血情況,皰疹癥狀在3～5 d 不等全部消退(見(jiàn)圖2 和表2)。

表1 CV-B2 的特異性引物Table 1 Specific primers for CV-B2

圖1 恒河猴感染CV-B2 體溫變化情況Figure 1 Changes in body temperature of the rhesus monkeys infected with CV-B2

2.2 血細(xì)胞和生化變化情況

2.2.1 血細(xì)胞指標(biāo)

感染CV-B2 后恒河猴嬰猴白細(xì)胞數(shù)從第1 天開始呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),第3 天回升,之后趨于平穩(wěn)(見(jiàn)圖3A);單核細(xì)胞在第1 天升高,然后下降,第4天開始上升恢復(fù)到正常水平(見(jiàn)圖3B);淋巴細(xì)胞數(shù)在感染后第1 天急劇下降,一直持續(xù)到第4 天達(dá)到最低點(diǎn),第5 天開始上升恢復(fù)到正常水平(見(jiàn)圖3C);嗜酸性粒細(xì)胞總體趨于上升趨勢(shì),在第1 天和第11 天出現(xiàn)急劇升高現(xiàn)象(見(jiàn)圖3D);嗜堿性粒細(xì)胞感染后第1 天出現(xiàn)急劇的下降,持續(xù)至11 d 逐步回升(見(jiàn)圖3E);中性粒細(xì)胞則總體處于上升趨勢(shì)(見(jiàn)圖3F)。

2.2.2 生化指標(biāo)

對(duì)恒河猴嬰猴的血清進(jìn)行生化檢測(cè),發(fā)現(xiàn)心肌酶、肝功、腎功都發(fā)生了相應(yīng)的改變,心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在第3 天、第5 天和第7 天出現(xiàn)明顯的升高(見(jiàn)圖4A、4B、4C)。 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白球比(A/G)、球蛋白(GLB)、總蛋白(TP)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)發(fā)生不同程度的增高(見(jiàn)圖4D、4E、4F、4G、4H),在第7 天均出現(xiàn)最高峰值。 血清尿素(UREA)在第5 天最高,隨后逐漸下降(見(jiàn)圖4I);血清肌酐(CREA)在感染后第1 天起急劇增高,一直持續(xù)到第14 天仍然處于較高水平(見(jiàn)圖4J)。

圖2 恒河猴嬰猴感染CV-B2 的皰疹情況Figure 2 Herpes infection in the rhesus monkeys infected with CV-B2

表2 恒河猴嬰猴感染CV-B2 的臨床癥狀Table 2 Clinical symptoms of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖3 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的血細(xì)胞的變化情況Figure 3 Changes in blood cells of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖4 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的血清生化的變化Figure 4 Changes in serum biochemistry of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

2.3 血液和皰疹PCR 的檢測(cè)結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR 產(chǎn)物,擴(kuò)增產(chǎn)物400 bp,擴(kuò)增條帶見(jiàn)圖5。 經(jīng)純化測(cè)序,單向測(cè)序得400 bp 序列,該序列與CV-B2 病毒序列完全一致。

2.4 病理觀察結(jié)果

感染后第5 天的皰疹組織通過(guò)鏡檢可以看到皰疹呈鱗狀上皮增厚,表面角化過(guò)度,局部壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),膿腫形成(見(jiàn)圖6)。

3 討論

圖5 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后血液皰疹檢測(cè)結(jié)果Figure 5 Blood herpes test results after the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖6 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的皰疹的病理改變(HE 染色)Figure 6 Pathological changes of herpes in the infant rhesus monkeys after CV-B2 infection(HE staining)

手足口病病毒感染動(dòng)物模型主要包括小鼠、乳鼠、免疫缺陷小鼠、受體基因修飾小鼠、樹鼩和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物等[11],主要研究集中在EV-A71,CVA16,CV-A6 和CVA10 病原體,引起神經(jīng)損傷、后肢麻痹以及呼吸道受累等癥狀[12-16]。 但是柯薩奇B病毒主要引起心臟、胰腺、肝、腎等組織器官的病變,不同的臨床CV-B 分離株與CAR 均有明顯的相互作用[17-18]。 早有報(bào)道顯示,大于90%的CV-B 感染發(fā)生在嬰兒、兒童和青少年中,因此,建立敏感的新生兒CV-B 感染的動(dòng)物模型對(duì)于發(fā)病機(jī)制的研究至關(guān)重要[19]。 有研究者利用3～4 周齡的C3H/He J小鼠先后進(jìn)行了CV-B3 和CV-B5 的感染,發(fā)現(xiàn)CVB3 感染可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)胰腺炎和心肌炎,而CV-B5感染只引起胰腺炎[20]。 Zhong 等[21]用CV-B5 感染3～4 周齡BALB/c 小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠在感染6 d 后出現(xiàn)了間質(zhì)性肺炎和心肌炎。 Dong 等[22]發(fā)現(xiàn)CV-B4在小鼠模型上可以發(fā)生皮質(zhì)視神經(jīng)水腫以及心肌炎的癥狀。 最新報(bào)道的韓國(guó)Hong 等[23]利用CVB2/04/279 建立的小鼠心肌炎和胰腺炎模型,該模型小鼠感染采用人工注射的方法,這種方式與經(jīng)呼吸道和消化道等自然感染過(guò)程具有一定差別,因此對(duì)該病毒感染評(píng)價(jià)方面會(huì)存在一些差異。 非人靈長(zhǎng)類作為高等級(jí)模式動(dòng)物,能夠感染腸道病毒的EV71 和CA16,至今非人靈長(zhǎng)類的CV-B2 模型尚未有報(bào)道[24]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CV-B2 經(jīng)口腔感染方式感染恒河猴嬰猴,感染后恒河猴出現(xiàn)WBC 降低,中性粒細(xì)胞升高,提示為病毒的感染,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中性粒細(xì)胞升高可作為診斷重癥手足口病患兒的一個(gè)參考指標(biāo),中性粒細(xì)胞的增高可能與機(jī)體特異性免疫(細(xì)胞與體液)功能較低、非特異性免疫炎癥反應(yīng)代償性增強(qiáng)有關(guān)。 淋巴細(xì)胞的減少可能是因?yàn)镃V-B2直接或者間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且凋亡對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。 CV-B2 感染機(jī)體后,單核細(xì)胞相應(yīng)的增加來(lái)吞噬病毒,緊接著將所攜帶的抗原決定簇轉(zhuǎn)交給淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的特異性免疫性反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)免疫應(yīng)答的發(fā)生。 研究結(jié)果中的嗜酸性粒細(xì)胞的升高提示啟動(dòng)了病毒感染的炎癥反應(yīng),釋放了炎性顆粒中的內(nèi)容物,引起組織損傷。

通過(guò)對(duì)手足口病嬰幼兒患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌酶譜的活性變化和持續(xù)時(shí)間與心肌細(xì)胞壞死程度呈正相關(guān),手足口病病程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心肌酶的指標(biāo)是有價(jià)值的[25]。 恒河猴感染CV-B2 后LDH、CK 升高表明不同程度的心肌損害,而CK-MB 是心肌特異性同工酶,在心肌細(xì)胞中含量最高,正常血清中含量極微,當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)釋放入血,故對(duì)判斷心肌損害具有高度特異性,因此CKMB 升高提示心肌的受損[26],因此我們預(yù)測(cè)在恒河猴嬰猴感染的早期就出現(xiàn)了心肌的損傷情況。

20 世紀(jì)初,就有相關(guān)報(bào)道指出CV-B2 與肝衰竭的相關(guān)性。 眾所周知,ALT、AST 是人體內(nèi)廣泛分布的酶,主要存在于肝臟、心臟組織細(xì)胞中,當(dāng)這些組織發(fā)生病變時(shí),該酶活力增多,表明在感染CV-B2后肝細(xì)胞受損,細(xì)胞膜通透性增加,胞漿內(nèi)的ALT、AST 釋放入血,導(dǎo)致血清濃度可升高。 恒河猴感染第7 天GLB 升高,可能是機(jī)體對(duì)抗病毒感染持續(xù)產(chǎn)生球蛋白發(fā)揮免疫作用。 TP 和GLB 水平表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì),這可能是二者與CV-B2 病毒感染后機(jī)體代謝增加有關(guān)。 多項(xiàng)臨床研究表明使用丙種球蛋白治療手足口病可以改善癥狀,加快恢復(fù)[27-28]。 Lin 等[29]人的研究也表明使用高劑量的丙種球蛋白治療重癥手足口病效果很好。 而A/G在第七天同時(shí)發(fā)生增高,說(shuō)明發(fā)生感染之后出現(xiàn)了肝臟的合成功能的異常。 同時(shí)CREA、UREA 的改變,同時(shí)使腎臟功能受到損傷并也可能發(fā)生了一定的病變。

通過(guò)RT-PCR 方法檢測(cè)血液和皰疹液中病毒,同時(shí)皰疹組織出現(xiàn)鱗狀上皮增厚,局部壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),膿腫形成等病理改變,可以確定引起恒河猴嬰猴出現(xiàn)一系列臨床癥狀的病原體為CV-B2,并出現(xiàn)病毒血癥的發(fā)生。

因此經(jīng)口腔方式(消化道)感染恒河猴嬰猴后出現(xiàn)體溫升高,手、足、口、生殖器等部位出現(xiàn)皰疹,血象、心肌酶、肝功能和腎功能的改變,結(jié)合RTPCR 和病理結(jié)果可以確定恒河猴嬰猴感染CV-B2后出現(xiàn)了典型的手足口病的癥狀和多器官的損傷。

基于以上研究的成果,我們認(rèn)為該模型選取的動(dòng)物年齡適當(dāng)、感染方式、樣本選取和檢測(cè)方法和技術(shù)是可行的,其所有結(jié)果均反映了一個(gè)較為完整的病毒感染的過(guò)程,能夠復(fù)制和再現(xiàn)相應(yīng)模型的臨床、病原、病理及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)情況,該研究結(jié)果為后續(xù)利用恒河猴感染建立CV-B2 手足口病模型,開展致病機(jī)制、病理學(xué)、免疫學(xué)以及藥物和疫苗的研發(fā)和評(píng)價(jià)等積累了資料、奠定了良好的基礎(chǔ)。