于秀石,朱 佳,魏麗麗,馬克濤,司軍強(qiáng),張忠雙,3?,田俊杰,羅 淑,魯廣森

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000; 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830000;3.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000)

新生兒缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension, HPH)是常見的威脅新生兒生命的急危重癥,疾病早期表現(xiàn)為肺血管痙攣,若及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行治療則可抑制血管痙攣,否則疾病發(fā)展到晚期則表現(xiàn)為肺血管重塑,發(fā)生不可逆的組織變化,此時(shí)期救治困難、死亡率高[1-2]。 目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,已知血管舒縮因子的平衡失調(diào)在發(fā)病過程中起了重要作用[3-4]。 在HPH 的發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1α (hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)的上游調(diào)節(jié)因子,參與HPH 的發(fā)生與發(fā)展[5]。miR-155 屬于小分子RNA,能通過與靶基因3’或5’非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)的結(jié)合,調(diào)控靶基因的表達(dá),參與機(jī)體的各種生物調(diào)控過程,如miR-155 在抑郁癥患者的血漿中的表達(dá)與多種炎癥因子相關(guān)。 胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)能有效促進(jìn)外周神經(jīng)再生,具有非選擇性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦室內(nèi)給予IGF-1,明顯減輕腦損傷區(qū)的神經(jīng)元缺失[6]。 在研究對(duì)HPH 的機(jī)制時(shí),IGF-1 上調(diào)miR-155 表達(dá)的作用非常重要,但miR-155 在肺損傷中的作用鮮有報(bào)道[7];且國(guó)內(nèi)尚無新生兒HPH 發(fā)生與IGF-1 相關(guān)的研究。 故而本研究通過建立HPH 新生大鼠模型,以尼莫地平為工具藥,探索在HPH 發(fā)病過程中,IGF-1 的作用機(jī)制,HIF-1α 和ET-1 的生理功能,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar 大鼠180 只,雌雄不限,日齡3 ～5 d (大鼠新生兒期),體質(zhì)量(20 ± 5) g,購(gòu)自海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滬)2019-0009]。 依據(jù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則給予適當(dāng)關(guān)照。 飼養(yǎng)及無菌手術(shù)在復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(滬)2019-0026],置于全自動(dòng)調(diào)節(jié)低壓艙,飼養(yǎng)條件：室溫21℃～25℃,相對(duì)濕度50%～65%,光暗循環(huán)12 h/12 h,自由飲水?dāng)z食。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查號(hào)：2019012304。

1.2 主要試劑與儀器

尼莫地平(國(guó)藥準(zhǔn)字H43020645,規(guī)格：每片30 mg,湖南百草制藥有限公司);鼠源性單克隆抗體(Anti-β-actin)(美國(guó)Amgen 公司);ELISA 試劑盒(美國(guó)R&D 公司);BCA 蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit)(美國(guó)BioVision 公司);TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 試劑盒(美國(guó)ABI 公司);Gel-Doc 凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司);Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)Leica 公司); NanoDrop 2000 蛋白/核酸分析儀(美國(guó)ThermoFisher 公司);高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman 公司);LightCycler480 高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)羅氏公司);TRIzol 裂解液(美國(guó)Invitrogen 公司)和RNase-free 水(美國(guó)ThermoFisher 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

新生大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,隨機(jī)分成3 組：模型組、給藥組及空白對(duì)照組。 將模型組和給藥組新生大鼠置于自制全自動(dòng)調(diào)節(jié)常壓低氧艙內(nèi)(大氣壓約50 kPa,氧濃度10%),制造間斷性低氧環(huán)境,以1.5 L/min 的速度輸入含10%的氮氧混合氣,予以氧濃度儀監(jiān)測(cè),維持氧濃度在9.5%～10.5%范圍內(nèi),控制二氧化碳濃度小于0.5%。 通過放置小風(fēng)扇維持低氧艙倉內(nèi)氣體均勻,通過減壓閥和電磁閥調(diào)節(jié)艙內(nèi)壓力,予以無水氯化鈣、鈉石灰吸收箱內(nèi)的水蒸氣與二氧化碳。 晝/夜為12/12,每天缺氧8 h,連續(xù)2 周。 分別于缺氧2、4、8、12 d 檢測(cè)肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP),mPAP≥6.5 pg/mL,且具有較強(qiáng)時(shí)間依賴性,則證明成功建立HPH 大鼠模型[8]。 缺氧同時(shí)給藥,其中給藥組每天灌胃給予3 mg/kg 尼莫地平。 空白對(duì)照組除不低氧,即大氣壓約50 kPa,氧濃度10%,其余條件相同,兩組大鼠放于同一房間以相同飲食飼養(yǎng),模型組及空白對(duì)照組每天灌胃給予生理鹽水。分別于缺氧2、4、8、12 d 依照隨機(jī)數(shù)字表法抽取模型組、給藥組及空白對(duì)照組大鼠各10 只進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。

1.3.2 mPAP 檢測(cè)

各組大鼠在被觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉后,固定實(shí)驗(yàn)大鼠,消毒頸、胸部皮膚,行氣管插管,給予機(jī)械通氣,潮氣量：2 ～3 mL/min,監(jiān)測(cè)新生大鼠尾部血氧飽和度(pulse oxygen saturation,SpOb),使其維持在(90 ± 5)%。 開胸,朝著血流的反方向?qū)澬晤^皮針一端緩慢扎進(jìn)肺動(dòng)脈根部,頭皮針另一端通過壓力傳感器連接生理通道記錄儀。對(duì)肺動(dòng)脈壓力曲線進(jìn)行記錄。

1.3.3 肺損傷組織病理形態(tài)學(xué)觀察

于缺氧12 d 給藥后2 h,處死大鼠,取肺部組織,4%甲醛固定,脫水進(jìn)行石蠟包埋,4 μm 進(jìn)行組織切片,二甲苯脫臘,蘇木精染,伊紅乙醇染色,二甲苯處理,中性樹脂進(jìn)行封膠固定,烘箱過夜處理,光鏡下觀察肺組織切片病理學(xué)變化。

1.3.4 Western blot 法檢測(cè)HIF-1α 和ET-1 在肺組織的表達(dá)

取“1.3.2”項(xiàng)下大鼠肺部組織,提取總蛋白,蛋白變性緩沖液變性,在硝酸纖維素膜上放置12.5%SDS-PAGE 膠轉(zhuǎn)膜后,3% BSA 4℃封閉過夜,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,分別摻入HIF-1α 和ET-1單克隆抗體(1 ∶500),在室溫下孵化45 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜。 二抗孵育,摻入HRP 標(biāo)記的二抗(1 ∶1000),室溫孵化30 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,ECL 發(fā)光并成像,以β-actin 作為內(nèi)參,檢測(cè)HIF-1α 各組的相對(duì)表達(dá),檢測(cè)肺部組織中的ET-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 采用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,并對(duì)圖片使用Image Pro Plus 6.0 進(jìn)行處理分析,將染色陽性顆粒的灰度單位轉(zhuǎn)換為吸光單位,并測(cè)量其密度(optical density,OD)值,以此作為其陽性表達(dá)的半定量。

1.3.5 ELISA 法檢測(cè)血清中HIF-1α 與ET-1 的表達(dá)

各組大鼠于觀察時(shí)間點(diǎn)采靜脈血0.5～1.0 mL,3000 r/min 離心15 min,提取上清液,置離心管置于-20℃冰箱備用。 使用ELISA 試劑盒,嚴(yán)格按照說明書操作,計(jì)算血清HIF-1α 與ET-1 的含量。

1.3.6 定量PCR 檢測(cè)肺組織的miR-155 mRNA表達(dá)

取出大鼠肺部組織研磨,加入1 mL TRIzol 裂解液,室溫靜置5 min,加入200 μL 氯仿混勻,室溫放置10 min。 離心取上層,加入等體積異丙醇于RNase-free 的1.5 mL 離心管中,冰浴30 min,在4℃,12 000 r/min 離心15 min,得到RNA 沉淀,空氣干燥RNA。 加入50 μL RNase-free 的水溶解RNA;利用NanoDrop 測(cè)定總抽提RNA,置于-20℃,備用。根據(jù)TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription kit試劑盒操作說明書,cDNA 產(chǎn)物由抽提的RNA 體外反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)得到;在16℃中孵化需要30 min;在42℃中孵化需要30 min;85℃加熱5 min,4℃保存。通過得到的cDNA 進(jìn)行PCR 熒光定量檢測(cè),在LightCycler480 儀器上操作,以U6 為內(nèi)參,miR-155的相對(duì)表達(dá)用ΔCT 來表示,95℃,預(yù)變性10 min,95℃15 s,60℃30 s,70℃30 s,共40 個(gè)擴(kuò)增周期,ΔCT=CTU6-CTmiR-155計(jì)算miR-155 mRNA 的相對(duì)表達(dá),引物信息見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 進(jìn)行分析,采用單因素方差分析計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn),以P＜0.05 認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀況比較

模型組大鼠反應(yīng)遲鈍,虛弱,體毛暗淡,蜷縮少動(dòng),精神萎靡,食量減少和體重下降等;空白對(duì)照組大鼠反應(yīng)敏捷,體毛光澤,飲食和體重正常;給藥組大鼠的反應(yīng)、體毛、飲食和體重介于空白對(duì)照組和模型組。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間段mPAP 比較

與空白對(duì)照組比,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著降低(P＜0.05),見表2。

2.3 各組大鼠肺組織HE 染色

空白對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰可見,間質(zhì)無滲出,無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡腔內(nèi)未發(fā)生水腫液與出血,肺泡壁完整;模型組肺微血管擴(kuò)張充血,雙肺體積增大,明顯肺水腫,大量紅細(xì)胞與液體從肺泡腔及肺泡隔內(nèi)滲出,可見浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞,偶然形成透明膜,大小各異的肺泡,肺泡間隔明顯增厚;給藥組大鼠其肺組織肺泡腔滲出、出血,毛細(xì)血管擴(kuò)張開并充血,較模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,見圖1。

2.4 不同時(shí)間段各組大鼠血清中HIF-1α 與ET-1水平比較

與空白對(duì)照組比,模型組大鼠缺氧2 d、4 d、8 d 和12 d 的HIF-1α 和ET-1 均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的HIF-1α 和ET-1均顯著降低(P＜0.05),見表3 和表4。

2.5 各組大鼠肺組織ET-1 蛋白表達(dá)檢測(cè)

與空白對(duì)照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α 和ET-1 蛋白表達(dá)均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α和ET-1 蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.05),見圖2 和表5。

表1 各引物序列信息Table 1 Primer sequence information

表2 各組大鼠不同時(shí)間段mPAP 比較(n=10)Table 2 Comparison of mPAP in the rats of different groups at different time of treatment (n=10)

圖1 各組大鼠肺組織的病理學(xué)改變Figure 1 Pathological changes in the lung tissues of rats in the three groups

表3 不同時(shí)間段各組大鼠血清中HIF-1α 水平比較(n=10)Table 3 Comparison of the serum HIF-1α levels at different times of rats in the three groups (n=10)

表4 不同時(shí)間段各組大鼠血清中ET-1 水平比較(n=10)Table 4 Comparison of serum ET-1 levels at different times of rats in the three groups (n=10)

圖2 Western blot 檢測(cè)大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達(dá)Figure 2 Western blot detection of the ET-1 expression in the rat lung tissues

表5 Western blot 檢測(cè)大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達(dá)(n=10)Table 5 Western blot detection of ET-1 expression in lung tissues of rats in the three groups (n=10)

2.6 各組大鼠肺組織miR-155 表達(dá)比較

與空白對(duì)照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達(dá)顯著降低(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達(dá)顯著增高(P＜0.05)。 進(jìn)一步從TargetScan 網(wǎng)站對(duì)miR-155 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),其與HIF-1α 的5’UTR 配對(duì)互補(bǔ),說明miR-155 可能是通過靶向結(jié)合HIF-1α 3’ UTR 調(diào)控其在肺組織中的表達(dá)水平。 見圖3 和表6。

圖3 各組大鼠肺組織miR-155 表達(dá)比較(n=10)Figure 3 Comparison of expression of microRNA-155 in lung tissue of rats in the three groups (n=10)

3 討論

3.1 HPH 的發(fā)病機(jī)制及病理生理

HPH 的相關(guān)研究認(rèn)為肺動(dòng)脈高壓的起始環(huán)節(jié)為缺氧所致肺微小動(dòng)脈內(nèi)皮損傷,細(xì)胞因子與血管活性物質(zhì)產(chǎn)生及異常釋放的原因?yàn)檠軆?nèi)皮受損導(dǎo)致功能失調(diào)引起[9]。 作用于血管平滑肌的血管舒縮因子平衡失調(diào),出現(xiàn)肺血管收縮為早期表現(xiàn),出現(xiàn)HPH,肺血管重建及肺血管壁病理改變?yōu)镠PH后期表現(xiàn)[10]。 其中越來越受到關(guān)注的為HIF-1α 的作用[11],生理活性由α 亞基的表達(dá)和活性決定的氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子,是在缺氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的、在體內(nèi)許多細(xì)胞中廣泛存在的。 HIF-1α 是介導(dǎo)機(jī)體對(duì)缺氧發(fā)生基因表達(dá)重新調(diào)整、肺血管收縮、肺血管重塑形成的中心環(huán)節(jié),在HPH 的發(fā)生過程中起著非常重要的作用[12]。 有研究表明缺氧早期低氧刺激肺組織產(chǎn)生大量HIF-1α,由于缺氧耐受效應(yīng)使得肺組織HIF-1α[13]表達(dá)隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)不再明顯提高。 本研究表明,在HPH 大鼠模型中,早期缺氧刺激能顯著提高HIF-1α 的表達(dá),而在缺氧后8 d和12 d 雖然也有增加,但HIF-1α 的表達(dá)相比于前期無顯著變化。

ET-1 是內(nèi)源性血管收縮因子,肺部是ET-1 作用和代謝的最重要臟器[14]。 ET-1 可能是促使肺血管強(qiáng)烈收縮導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓發(fā)生過程中的一個(gè)重要因素[15]。 本次研究結(jié)果表明,在模型組新生大鼠缺氧2 d 起血清ET-1 即明顯增高,并持續(xù)至12 d,同時(shí)在模型組大鼠肺組織中ET-1 蛋白也存在著顯著高表達(dá)。 其原因可能為：在缺氧早期血管內(nèi)皮細(xì)胞在低氧刺激下產(chǎn)生大量HIF-1α,HIF-1α 誘導(dǎo)下游靶基因ET-1 高表達(dá)。 肺血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上ET-B受體與通過自分泌途徑異常升高的ET-1 相結(jié)合,生成大量氧自由基,對(duì)肺動(dòng)脈高壓損傷程度加重與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞本身的脂質(zhì)造成過氧化損害[16]。?

表6 miR-155 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Table 6 Predictive results of target genes for microRNA-155

3.2 IGF-1 上調(diào)miR-155 表達(dá)對(duì)HPH 的作用

IGF-1 作為體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子,對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用[17-18];已有相關(guān)研究報(bào)道稱IGF-1 可防治高氧肺損傷[19-20]。 在對(duì)HPH 大鼠模型進(jìn)行現(xiàn)非侵入性鼻腔滴入IGF-1 后發(fā)現(xiàn),肺部組織損傷明顯降低,說明入IGF-1 對(duì)大鼠低氧肺動(dòng)脈高壓肺組織損傷有保護(hù)作用。 通過檢測(cè)給藥組大鼠肺組織HIF-1α 以及ET-1 的表達(dá)發(fā)現(xiàn),其在肺組織中的表達(dá)水平得到了明顯的抑制,表明IGF-1 可能通過作用于HIF-1α,進(jìn)而抑制ET-1 的表達(dá),發(fā)揮對(duì)肺組織的保護(hù)作用[21]。

IGF-1R mRNA 可在大鼠肺小動(dòng)脈壁上正常表達(dá)。 IGF-1 可特異結(jié)合細(xì)胞膜ICG-1R,傳導(dǎo)其刺激增殖信號(hào),引發(fā)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等效應(yīng)。 ICG-1R 受激活后可影響大部分細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化過程,同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[22]。 本次研究表明,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 平均水平為均顯著高于空白對(duì)照組mPAP 對(duì)應(yīng)時(shí)間的平均水平,各時(shí)間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示經(jīng)低氧環(huán)境培養(yǎng)后,大鼠可產(chǎn)生低氧性肺血管重建和缺氧性肺動(dòng)脈高壓。 Dogansen 等的研究[23]表明,肺動(dòng)脈高壓的大鼠中,肺小動(dòng)脈壁miR-155 水平明顯減少。 分析原因,在低氧性肺血管重建過程中, IGF-1R 不僅擔(dān)任受體角色,而且可引導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞從收縮表型轉(zhuǎn)化成合成表型,促進(jìn)細(xì)胞增殖。 而血管壁結(jié)構(gòu)構(gòu)成與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)。 綜上,IGF-1R 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡的作用,因此有利于血管壁結(jié)構(gòu)重建,而miR-155 是IGF-1R mRNA 中重要的抑制因子[24]。 因此,低氧條件時(shí),肺小動(dòng)脈壁miR-155 水平的降低與低氧性肺血管重建具有重要的關(guān)聯(lián),適當(dāng)提升其水平有利于改善HPH 病情[25]。

在分子水平上采用定量PCR 檢測(cè)肺組織中miR-155 的表達(dá)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組大鼠比,模型組大鼠肺部組織中miR-155 表達(dá)明顯下降,差異具有顯著性。 與模型組大鼠比,IGF-1 給藥后大鼠肺組織中miR-155 表達(dá)的平均水平則明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),其可能通過靶向結(jié)合HIF-1α 5’UTR,調(diào)控其在肺組織中的表達(dá)。

低氧作為始動(dòng)因素通過誘導(dǎo)HIF-1α 及其ET-1的表達(dá),IGF-1R 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡的作用,miR-155 對(duì)IGF-1R 的抑制作用減弱,導(dǎo)致肺血管收縮與增生異常,進(jìn)而導(dǎo)致HPH 肺組織損傷。 IGF-1 可顯著上調(diào)肺組織中miR-155 的表達(dá),降低IGF-1R 的細(xì)胞增殖作用并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,一定程度上保護(hù)肺組織損傷的發(fā)生,對(duì)臨床治療缺氧性肺動(dòng)脈高壓引發(fā)的肺損傷提供理論依據(jù)。