付 強(qiáng)，李國(guó)政，林奕云，楊 繼，蔡群娣，張東豫，邱建華*

1. 廣東省測(cè)試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市越秀區(qū)先烈中路100 號(hào)34 棟504 510070

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)開(kāi)區(qū)第三大街8 號(hào) 450000

3. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號(hào) 650031

無(wú)煙氣煙草制品(Smokeless tobacco products,STPs)是指不經(jīng)燃燒、直接通過(guò)口腔或鼻腔吸食的煙草制品［1］。與傳統(tǒng)卷煙相比，無(wú)煙氣煙草因?yàn)榫哂形：π暂^小、不產(chǎn)生二手煙、不受場(chǎng)所限制等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注［2］。其中，膠基型無(wú)煙氣煙草制品最早是由瑞典火柴公司首先研發(fā)成功并試投放市場(chǎng)［3］，是一種以煙草或煙草提取物為有效組分，以可食用膠基為載體，添加了香精香料、軟化劑、甜味劑等食品添加劑，通過(guò)咀嚼方式向人體遞送煙堿的新型煙草制品［4］。近年來(lái)，隨著全球控?zé)熩厔?shì)的加劇及消費(fèi)者對(duì)健康的日益關(guān)注，新型煙草制品相關(guān)研究已成為煙草行業(yè)重要的研究方向之一，膠基型嚼煙分析檢測(cè)方面的研究目前主要集中在煙堿等成分的分析方面。楊繼等［5］用GC-MS 法測(cè)定了膠基型嚼煙中煙堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；張杰等［6］測(cè)定了國(guó)外口含型無(wú)煙氣煙草制品總煙堿、游離煙堿和煙草特有亞硝胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；張文娟等［7］研究了膠基型無(wú)煙氣煙草制品中煙堿的釋放行為。

甜味劑是一種重要的食品添加劑，按其來(lái)源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑［8］，膠基型嚼煙的甜味通常是由添加的甜味劑帶來(lái)的。與常見(jiàn)的糖類(lèi)物質(zhì)相比，甜味劑因具有甜度高、熱量低、不易引起齲齒等特點(diǎn)，特別適合在膠基型嚼煙中使用。但是，由于各種天然或合成甜味劑往往帶有一定的風(fēng)味特征或異味，在膠基型嚼煙中添加時(shí)，考慮到膠基型嚼煙的風(fēng)格特征，甜味劑品種和添加量的選擇顯得尤為重要。美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）對(duì)于甜味劑添加限量要求為“適量”添加。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各種食品中甜味劑的添加量進(jìn)行了明確限定［9］。隨著新型煙草制品的研究和開(kāi)發(fā)，急需建立膠基型嚼煙中甜味劑的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)及方法，為膠基型嚼煙中甜味劑的安全使用提供技術(shù)依據(jù)。

目前，甜味劑的測(cè)定方法主要有離子色譜法［10］、毛細(xì)管電泳法［11］、HPLC 法［12-13］、LC-MS 法［14-16］等。由于LC-MS/MS 法的前處理相對(duì)簡(jiǎn)單、選擇性強(qiáng)、靈敏度高以及抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，目前已應(yīng)用于食品添加劑的測(cè)定［17-19］。但是目前各種方法測(cè)定的主要是7 種人工合成甜味劑，尚未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定13 種天然和合成甜味劑的方法報(bào)道。本研究中采用UPLC-MS/MS 法對(duì)膠基型嚼煙中13 種天然甜味劑和合成甜味劑進(jìn)行分析研究，旨在為膠基型嚼煙甜味劑的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

膠基型嚼煙由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，樣品先用粉碎機(jī)粉碎，選擇粒徑＜5 mm的樣品顆粒進(jìn)行下一步測(cè)定。

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Honeywell 公司）；甲酸（99%）、乙酸（99.8%）（上海晶純?cè)噭┕荆?；正己烷（AR，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)）；甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、山梨糖醇（≥97%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）；紐甜（99.0%，加拿大TRC 公司）；甜菊糖苷、甘露糖醇、木糖醇（≥98.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；麥芽糖醇（≥99%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇［≥99%，美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)品(USP)］；水為自制超純水。

1290 超高效液相色譜儀、6460A 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；CF16RXII 冷凍離心機(jī)（日本Hitachi 公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；BT125D 電子天平（感量0.000 01 g, 德國(guó)Sartorius 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜味劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

分別稱(chēng)取13種天然和合成甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配制成濃度均為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇儲(chǔ)備液，用超純水稀釋配制成濃度均為10 μg/mL的天然甜味劑混合儲(chǔ)備液。分別取安塞蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷儲(chǔ)備液，用超純水稀釋配制成10 μg/mL 的合成甜味劑混合儲(chǔ)備液。所有儲(chǔ)備液于4 ℃冷藏保存。

取天然甜味劑和合成甜味劑的混合儲(chǔ)備液，用超純水稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛确謩e為10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理與分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 膠基型嚼煙樣品于50 mL離心管中；加入5 mL 正己烷，渦旋混勻并超聲處理10 min；然后加入10 mL 超純水，振蕩提取10 min，渦旋混勻1 min；于3 000 r/min 離心，轉(zhuǎn)移中間水相部分于25 mL容量瓶中。離心管中繼續(xù)加入10 mL 超純水重復(fù)提取一次，取水相與上一次提取液合并，用超純水定容。移取1.00 mL提取液于10 mL具塞試管中，加入2 mL正己烷，渦旋混合1 min，靜置分層，吸取下層水相過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析。分析條件：

（1）合成甜味劑。色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：甲醇（A），水（B）；流速：0.4 mL/min；梯度程序：0～2.5 min 20%～90% A，2.5～3.5 min 90%A，3.5～5.0 min 20%A。

（2）天然甜味劑。色譜柱：GRACE Prevail Carbohydrate ES 柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A），水（B）；流速：0.4 mL/min；梯度程序：0～5 min 10%B，5～16 min 10%～40%B，16～19 min 40%～75%B，19～20 min 10%B。

質(zhì)譜離子源：帶鞘流氣的AJS ESI 源；檢測(cè)模式：負(fù)離子模式；檢測(cè)方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：5.0 mL/min；噴霧氣壓力：0.31 MPa；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流量：11 L/min；毛細(xì)管電壓：-3 500 V；噴嘴電壓：-500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜味劑質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別使用濃度為10.0 μg/mL 的天然甜味劑和合成甜味劑混合溶液，通過(guò)直接進(jìn)樣的方式在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀上對(duì)離子源參數(shù)、母離子與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式二級(jí)碎片離子的質(zhì)荷比、碎裂電壓（Fragmentor）、碰撞能（CE）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，各種甜味劑的離子信息見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)中的天然甜味劑和合成甜味劑大多帶有羧基或羥基官能團(tuán)，在電噴霧質(zhì)譜的負(fù)離子模式下可以獲得較好的檢測(cè)靈敏度。

表1 7 種合成甜味劑和6 種天然甜味劑的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab.1 MRM parameters of 7 synthetic sweeteners and 6 natural sweeteners

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了各種不同的色譜柱對(duì)合成甜味劑和天然甜味劑的分離效果，合成甜味劑與天然糖醇類(lèi)甜味劑因分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大，只能在不同色譜柱上分別進(jìn)行分離。分別選用反相色譜柱和糖柱分離合成甜味劑和天然糖醇類(lèi)甜味劑。

7 種合成甜味劑的分子結(jié)構(gòu)大都具有芳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，且分子結(jié)構(gòu)有明顯差異，可以在反相液相色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent SB-C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus C18ARHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）4 種色譜柱對(duì)合成甜味劑的保留和分離能力，結(jié)果見(jiàn)表2。綜合考慮選用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm, 2.7 μm）柱作為7 種合成甜味劑的分析柱。

天然糖醇類(lèi)化合物中含有較多的羥基等親水結(jié)構(gòu)，在常見(jiàn)反相色譜柱和親水作用色譜（HILIC）柱上均無(wú)法進(jìn)行正常分離。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了兩種專(zhuān)用的糖柱Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm, 5 μm）和GRACE Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm,5 μm）對(duì)6 種天然糖醇類(lèi)甜味劑的色譜分離性能。在Shodex Asahipak NH2P-50 4E 柱上，山梨糖醇+甘露糖醇和麥芽糖醇+異麥芽酮糖醇這兩對(duì)同分異構(gòu)體無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離，而GRACE Prevail Carbohydrate ES在乙腈-水流動(dòng)相體系中可以較好地分離6 種天然糖醇類(lèi)化合物。 因此選用GRACE Prevail Carbohydrate ES 柱作為天然甜味劑的分離柱。6 種天然甜味劑在不同色譜柱上的分離效果見(jiàn)圖1。

表2 4 種反相色譜柱對(duì)7 種合成甜味劑的分離效果Tab.2 Separation of 7 synthetic sweeteners by 4 reversed-phase columns

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈-水體系和甲醇-水體系作為流動(dòng)相在Poroshell 120 EC-C18色譜柱上對(duì)合成甜味劑的分離效果，分離合成甜味劑的總離子流色譜圖和MRM色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，甲醇-水作為流動(dòng)相對(duì)合成甜味劑的分離度更高，這可以解釋為甲醇在反相體系中相對(duì)于乙腈具有較弱的洗脫能力，具有一定極性的合成甜味劑在甲醇體系中的保留時(shí)間更長(zhǎng)，從而表現(xiàn)出更明顯的差異性。7 種合成甜味劑的出峰時(shí)間在1.5～3.0 min 之間，從總離子流色譜圖上看，幾種合成甜味劑不能實(shí)現(xiàn)完全分離，其中糖精鈉和安賽蜜的保留時(shí)間重合，阿斯巴甜和三氯蔗糖的保留時(shí)間接近。但因?yàn)檫@兩種化合物的質(zhì)荷比相差很大，在質(zhì)譜MRM 檢測(cè)模式下基本不存在干擾，保留時(shí)間的重合不影響同時(shí)測(cè)定。

圖1 6 種天然甜味劑在不同糖柱上的分離效果Fig.1 Separation of 6 natural sweeteners by different sugar columns

圖2 合成甜味劑和天然甜味劑的總離子流色譜圖和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 TIC and MRM chromatograms of synthetic sweeteners and natural sweeteners

另外優(yōu)化了GRACE Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm, 5 μm）糖柱在乙腈-水流動(dòng)相體系下對(duì)6種天然糖醇類(lèi)甜味劑的梯度洗脫條件。天然糖醇的總離子流色譜圖和MRM色譜圖見(jiàn)圖2。在6種天然糖醇類(lèi)物質(zhì)中，山梨糖醇和甘露糖醇互為同分異構(gòu)體，麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇互為同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)非常接近且MRM檢測(cè)參數(shù)也幾乎一致，無(wú)法通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜相互區(qū)分，因此對(duì)色譜分離提出了較高的要求。在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的梯度淋洗條件下，6種糖醇類(lèi)物質(zhì)的分離效果較為滿(mǎn)意，山梨糖醇和甘露糖醇接近實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇完全達(dá)到基線(xiàn)分離。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中涉及的合成甜味劑和天然甜味劑均易溶于水。測(cè)定常規(guī)食品中的甜味劑可用水相進(jìn)行提??；但膠基型嚼煙中的基礎(chǔ)物質(zhì)是膠基，其主要成分是天然樹(shù)膠、聚醋酸乙烯樹(shù)脂和丁苯橡膠，還含有橡膠軟化劑、增塑劑、乳化劑、填充料等。由于膠基的存在，樣品難以被粉碎成細(xì)小顆粒且不溶于水，無(wú)法直接用水相提取。根據(jù)膠基的性質(zhì)，可以先將樣品粉碎成較大的顆粒，然后用有機(jī)溶劑溶解、溶脹其中的膠基，再用水相提取。對(duì)比了正己烷、四氫呋喃、二氯甲烷對(duì)樣品中膠基的溶解效果，結(jié)果表明，3 種有機(jī)溶劑均可快速溶解樣品顆粒中的膠基形成懸濁液。綜合考慮環(huán)境影響和試劑成本，最終選擇毒性較小、價(jià)格較低的正己烷作為預(yù)處理溶劑。

將膠基嚼煙樣品用正己烷進(jìn)行預(yù)處理后，可用近似液液萃取的方式對(duì)其中的水溶性物質(zhì)進(jìn)行提取。對(duì)比了使用純水、甲醇-水（1∶1）、乙腈-水（1∶1）作為提取溶劑對(duì)空白加標(biāo)樣品中甜味劑的提取效果。圖3 中的結(jié)果表明用純水作為提取劑的提取率高于甲醇/水和乙腈/水，其中原因可能是甲醇/水和乙腈/水體系中溶解了較多的脂溶性成分，在質(zhì)譜鑒定環(huán)節(jié)影響了被測(cè)物質(zhì)甜味劑的離子化效率。根據(jù)以上結(jié)果，采用純水作為甜味劑的提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)甜味劑提取效率的影響Fig.3 Effects of extraction solvents on extraction efficiencies of sweeteners

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

膠基型嚼煙類(lèi)樣品中所含的磷脂等脂溶性成分可能在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)干擾甜味劑的離子化過(guò)程，因此有必要對(duì)提取液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了不凈化直接測(cè)定、HLB 柱固相萃取凈化［9］和正己烷液-液萃取快速凈化對(duì)加標(biāo)樣品測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)Waters Oasis HLB 固相萃取柱凈化和正己烷快速凈化后的樣品提取液，除安賽蜜外的其他甜味劑的響應(yīng)值均高于未經(jīng)凈化的樣品提取液。正己烷凈化與固相萃取凈化效果相近，且成本低、操作簡(jiǎn)便，故選擇正己烷液-液萃取快速凈化方法進(jìn)行樣品提取液的凈化。

2.4 線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限

按1.2.1 節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在LC-MS/MS儀上進(jìn)行分離檢測(cè)，利用基質(zhì)加標(biāo)的方式得出實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，然后分別以甜味劑的濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸。分別按S/N=3 和S/N=10 計(jì)算檢出限和定量限。各甜味劑的線(xiàn)性方程和相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，13 種甜味劑線(xiàn)性回歸方程的R2在0.990 7～0.999 6 之間，說(shuō)明13 種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)性良好。

圖4 凈化條件對(duì)13 種甜味劑檢測(cè)的影響Fig.4 Effects of clean-up conditions on recoveries of 13 sweeteners

表3 13 種甜味劑的線(xiàn)性回歸方程、R2、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Linear regression equations, R2, linear ranges, limits of detection, limits of quantitation of 13 sweeteners

經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化下，13 種甜味劑的方法檢出限分別在6.8×10-6～0.30 μg/kg之間，定量限分別在2.3×10-5～1.0 μg/kg 之間，優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法［9］，各甜味劑的線(xiàn)性范圍為0.001～1.0 μg/mL，可以滿(mǎn)足膠基型嚼煙的檢測(cè)需求。

2.5 準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性

經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，測(cè)定5、50、500 μg/kg 3 個(gè)添加水平的膠基型嚼煙樣品中的各種甜味劑，計(jì)算各物質(zhì)的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4?？芍?種添加水平下，13種甜味劑的加標(biāo)回收率分別在80.2%～95.0%、84.8%～97.6%、83.1%～95.1%之間，說(shuō)明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性較高。

為考察方法的精密度，進(jìn)行了加標(biāo)樣品的日內(nèi)和日間重復(fù)測(cè)定，對(duì)各樣品分別進(jìn)行6 次平行測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算各甜味劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD范圍分別為1.35%～5.56%，3.13%～7.00%，均小于10%，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性較好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

按優(yōu)化分析方法測(cè)定了10 種膠基型嚼煙樣品中各種甜味劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表5?？芍?，10 種膠基型嚼煙樣品中均檢出了甜味劑，主要有木糖醇、麥芽糖醇、山梨糖醇、紐甜、糖精鈉、安賽蜜。各樣品中普遍檢出3 種以上甜味劑。其中天然甜味劑的檢出現(xiàn)象較為普遍，除甘露糖醇、赤蘚糖醇外的其他天然糖醇均有檢出，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.9～857 mg/kg范圍內(nèi)。合成甜味劑中三氯蔗糖的檢出率相對(duì)較高，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.18～1.05 mg/kg 之間。結(jié)合嚼煙口味分析可知，具有植物提取物風(fēng)味的嚼煙中主要添加的是山梨糖醇和麥芽糖醇，而調(diào)配的嚼煙中主要是木糖醇和麥芽糖醇?？傮w而言，檢出甜味劑的情況與標(biāo)簽基本相符，且并未超過(guò)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［9］對(duì)食品相關(guān)甜味劑允許使用量的限值，說(shuō)明樣品中甜味劑的添加情況處于安全范圍。

表4 LC-MS/MS 法測(cè)定膠基型嚼煙中甜味劑的加標(biāo)回收率和精密度Tab.4 Spiked recoveries, intra-and inter-day RSDs of sweeteners

表5 膠基型嚼煙樣品中甜味劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果Tab.5 Contents of synthetic sweeteners and natural sweeteners in gum-based chewing tobacco samples （mg·kg-1）

3 結(jié)論

①優(yōu)化并建立了測(cè)定膠基型嚼煙中7 種合成甜味劑和6 種天然糖醇類(lèi)甜味劑的UPLC-MS/MS 法：改進(jìn)了樣品的前處理，既降低了基質(zhì)干擾，又減少了時(shí)間和溶劑消耗；優(yōu)化了反相柱和專(zhuān)用糖柱色譜分離條件，實(shí)現(xiàn)了甜味劑組分的完全、快速分離；能滿(mǎn)足膠基型嚼煙中甜味劑簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的要求；②對(duì)10 種膠基型嚼煙中各種甜味劑的檢測(cè)結(jié)果表明樣品中甜味劑的添加情況處于安全范圍。