張麗娜， 侯樂樂， 劉祖霖， 李平甘， 黃思琪， 孟 哲， 歐 輝， 江轉(zhuǎn)南， 梁立陽

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科， 廣東 廣州 510260)

自1865年發(fā)現(xiàn)遺傳性血色病患者的2型糖尿病患病風(fēng)險增加以來，鐵過載與2型糖尿病之間的聯(lián)系開始受到廣泛重視。隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，無論是1型或2型糖尿病還是妊娠期糖尿病，絕大部分患者都存在鐵代謝指標(biāo)的增高[1-2]。甚至在正常人群中，每日膳食中每增加1 mg血紅素鐵的攝入可使2型糖尿病患病風(fēng)險增加1.16倍[3]。因此，過量的微量元素鐵是促進(jìn)糖尿病的一個危險因素[4]，其機(jī)制可能與胰島β細(xì)胞受損或者胰島素抵抗有關(guān)，但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。既往研究多集中在鐵過載與胰島素抵抗的關(guān)系[5-7]，然而過量鐵導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷甚至死亡的機(jī)制尚不明確。因此，為探究慢性鐵過載對胰島β細(xì)胞的直接影響及鐵毒性機(jī)理，我們擬通過體外培養(yǎng)具有大鼠胰島β細(xì)胞生理特性的胰島素瘤細(xì)胞株INS-1細(xì)胞，用枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC)建立慢性鐵過載模型，以觀察鐵過載對INS-1細(xì)胞活力、胰島素分泌功能及線粒體的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞 INS-1細(xì)胞購自上海歌凡生物科技有限公司，傳代培養(yǎng)。

1.2試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；β-巰基乙醇和FAC(Sigma)；Calcein-AM(上海翊圣生物科技有限公司)；CCK8試劑和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(碧云天)；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢純度生物科技)；JC-1(聯(lián)科生物)。

1.3儀器 SW-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州凈化有限公司)；水套式CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀和離心機(jī)(Thermo)；流式細(xì)胞儀(BD，F(xiàn)ACSCalibur)；全波長酶標(biāo)儀(Multiskan GO)；5200凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；透射電子顯微鏡(JEM-1400/JEM-1400 PLUS)。

2 方法

2.1INS-1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，以每孔200 μL接種在96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2INS-1細(xì)胞鐵過載模型建立

2.2.1實驗分組 對照(control)組：INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)液中不加枸櫞酸鐵銨(FAC)，常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。鐵過載組：培養(yǎng)液中分別含5、10、20、40、80、160和320 μmol/L的FAC在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h、48 h和72 h后，棄液，Hanks液洗3次，分別加入無血清培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育20 min。

2.2.2細(xì)胞不穩(wěn)定變鐵池(labile iron loop，LIP)的檢測 為驗證FAC能進(jìn)入細(xì)胞成為LIP，通過calcein-AM標(biāo)記不同的處理組細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組calcein-AM的熒光強(qiáng)度。具體操作如下：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，收集不同濃度FAC處理的細(xì)胞，以相同培養(yǎng)時間不加FAC進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2次，重懸細(xì)胞于PBS中，調(diào)細(xì)胞濃度為1×109/L，加入calcein-AM，終濃度為0.125 mol/L，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育15 min，洗去過多的calcein-AM，重懸于PBS中，流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光強(qiáng)度。LIP水平與熒光強(qiáng)度呈反比，熒光淬滅率越高，表明進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鐵越高。

2.2.3CCK8法檢測細(xì)胞活力 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞消化下來，根據(jù)計數(shù)情況及接種量(每孔8 000個)制備細(xì)胞懸液(每孔200 μL)；將制備好的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)預(yù)培養(yǎng)過夜，換液加入對應(yīng)濃度的FAC，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，向每孔加入20 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A值)。

2.3胰島素測定 取細(xì)胞的培養(yǎng)基上清，3 000 r/min離心10 min去除顆粒和聚合物后作為待測樣品。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min，將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)值。

2.4ROS的檢測 熒光探針CM-H2DCFDA體積比為1 000 ∶1的比例配制ROS探針染色液。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%后每孔加入1.5 mL染色液，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2遍，消化細(xì)胞形成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組熒光強(qiáng)度。

2.5細(xì)胞線粒體膜電位的檢測 胰酶消化細(xì)胞后重懸于PBS中清洗2次，棄去PBS上清，向每管加入1 000 μL 溫?zé)峋彌_液；每孔在加入5 μmol/L JC-1，輕輕混勻后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育(避光)5 min。PBS清洗2次，1 500 r/min離心5 min。每管細(xì)胞500 μL PBS重懸后過濾到流式管，流式細(xì)胞術(shù)分析檢測。

2.6透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài) 生長在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上細(xì)胞取材，離心成團(tuán)，去上清。沿壁緩慢加入電鏡固定液(1.5%～2.5%中性戊二醛)，4 ℃下固定2 h或以上，漂洗6次,每次30 min。1% 鋨酸固定30～60 min后再漂洗3次，每次5 min。梯度脫水后樹脂滲透，利用包埋模具、Epon812純樹脂包埋，固化后超薄切片，厚度50～70 nm。鈾鉛雙染色后沖洗切片，烤燈下烤15 min使切片徹底干燥后，透射電子顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及Dunnett’s檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 INS-1細(xì)胞內(nèi)calcein水平的變化

24 h、48 h和72 h 3組的對照組間INS-1細(xì)胞內(nèi)calicein-AM熒光強(qiáng)度無顯著差異。加入不同濃度的FAC后，INS-1細(xì)胞內(nèi)calcein-AM的平均熒光強(qiáng)度均低于同培養(yǎng)時間的對照組，各濃度FAC組與同培養(yǎng)時間的對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The changes of mean fluorescence intensity of calcein in the INS-1 cells treated with different concentrations of FAC for different time.

2 INS-1細(xì)胞活力的變化

24 h組：加入不同濃度的FAC后，細(xì)胞活力較對照組降低，其中20和320 μmol/L組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；48 h組：加入不同濃度的FAC后，細(xì)胞活力較對照組降低，其中5、10、20、80、160和320 μmol/L組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；72 h組：各濃度FAC組均與對照組相比，細(xì)胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The viability of INS-1 cells exposed to FAC at different concentrations for different time. Mean±SD. n=3.

以LIP相對水平最高、細(xì)胞相對活力大于50%為原則，選取48 h組FAC濃度為80、160和320 μmol/L為后續(xù)實驗的鐵過載組，細(xì)胞活力分別是對照組的66%、64%和60%。

3 INS-1細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌的變化

ELISA法檢測INS-1細(xì)胞中胰島素水平，與對照組相比，80和160 μmol/L FAC組的胰島素分泌逐漸增多，但僅160 μmol/L組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；320 μmol/L組與對照組相比胰島素分泌減少(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Insulin changes in the INS-1 cells exposed to FAC at different concentrations. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.

4 INS-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化

與對照組相比，鐵過載組細(xì)胞內(nèi)ROS水平均增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.ROS level was significantly increased in the INS-1 cell iron overload model. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.

5 INS-1細(xì)胞線粒體膜電位的變化

鐵過載組與對照組相比，線粒體膜電位逐漸降低(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Mitochondrial membrane potential was decreased in the INS-1 cell iron overload model. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 μmol/L group.

6 INS-1細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化

鐵過載組隨著FAC濃度增加，線粒體形態(tài)破壞逐漸加重，表現(xiàn)為內(nèi)嵴腫脹，排列松散，部分呈空泡樣，與對照組相比，可見致密鐵分子顆粒，見圖6。

討 論

適量鐵是機(jī)體代謝過程中必不可少的組件，然而機(jī)體內(nèi)鐵水平增高可導(dǎo)致包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病。構(gòu)建慢性鐵過載誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷和死亡的模型是深入了解其病理生理機(jī)制的首要環(huán)節(jié)。人體游離鐵存在于不穩(wěn)定池中，包括了血漿中的非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin-bound iron，NTBI)和紅細(xì)胞中的LIP。FAC是一種生理形式上的NTBI，主要用于慢性鐵過載實驗當(dāng)中。LIP的定量檢測被認(rèn)為是衡量細(xì)胞內(nèi)鐵過載的瞬時參數(shù)，可以反映細(xì)胞內(nèi)鐵的沉積程度[8]；calcein平均熒光強(qiáng)度越低，細(xì)胞內(nèi)LIP水平越高。盧文藝等[9]等在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的過程中添加FAC(100、200和400 μmol/L)培養(yǎng)12、24和48 h，發(fā)現(xiàn)較對照組LIP明顯增高；Park等[10]用150 μmol/L的FAC培養(yǎng)海馬HT-22神經(jīng)元48 h，發(fā)現(xiàn)鐵過載導(dǎo)致細(xì)胞活力的下降，細(xì)胞死亡。但目前國內(nèi)外尚缺乏公認(rèn)的可用于慢性鐵過載損傷機(jī)制研究的胰島β細(xì)胞模型。本研究亦選擇FAC構(gòu)建胰島β細(xì)胞(INS-1細(xì)胞)的慢性鐵過載模型，用INS-1細(xì)胞體外添加不同濃度(5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)的FAC，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，以探索建立胰島細(xì)胞鐵過載模型的條件。

我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AC能夠誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞內(nèi)慢性鐵過載，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)INS-1細(xì)胞隨著FAC濃度增加及時間的延長，calcein的平均熒光強(qiáng)度逐漸降低，提示共培養(yǎng)的時間越長、濃度越高，其細(xì)胞內(nèi)鐵沉積越明顯，而INS-1細(xì)胞活力逐漸下降。這說明胰島β細(xì)胞對FAC較為敏感，F(xiàn)AC可引起胰島β細(xì)胞數(shù)目減少。既往研究發(fā)現(xiàn)，不論1型糖尿病還是2型糖尿病，胰島β細(xì)胞的衰竭被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病的先決條件[11-12]，即使是很嚴(yán)重的肥胖或者胰島素抵抗的患者，如果胰島β細(xì)胞數(shù)目不下降，也不一定會發(fā)展為糖尿病。不僅如此，我們在實驗中同時發(fā)現(xiàn)，在一定的FAC濃度范圍，INS-1細(xì)胞分泌胰島素并不會減少，甚至出現(xiàn)短暫升高的趨勢，只有當(dāng)細(xì)胞數(shù)量降低到大約60%以下，才會出現(xiàn)胰島素分泌的減少。也就是說，隨著鐵的沉積，胰島β細(xì)胞數(shù)目減少的初期，胰島素代償性分泌增多。這種現(xiàn)象可能與胰島素的分泌機(jī)制有關(guān)：胰島素的分泌與電子傳遞鏈中產(chǎn)生的ATP有關(guān)，而細(xì)胞內(nèi)的鐵參與了電子傳遞鏈中大部分復(fù)合物的組成。有研究提出，減少細(xì)胞內(nèi)鐵的排出對于胰島素的分泌是一個正向的促進(jìn)作用[13]。但由胰島素代償性增多轉(zhuǎn)為分泌減少過程中的關(guān)鍵節(jié)點及分子機(jī)制目前尚不明確，除了細(xì)胞數(shù)目的進(jìn)一步減少外，是否有其他的信號通路仍需要進(jìn)一步的研究。該過程也有可能成為早期有效干預(yù)糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

Figure 6.The morphologic changes of mitochondrial structure under TEM. A: the mitochondrial electron density was high in control group, and the mitochondrial cristae were arranged neatly; B: in FAC 80 μmol/L group, the mitochondria as well as their cristae were slightly swollen and a small amount of iron molecular particles appeared in the cytoplasm; C and D: in high FAC concentration groups, the mitochondria and their cristae were obviously swollen, the arrangement of the cristae was disoriented, some mitochondria were vacuolated, and iron molecular particles appeared in the cytoplasm.

在體內(nèi)，鐵可以通過Fenton反應(yīng)催化ROS的生成，當(dāng)產(chǎn)生的ROS超過了細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)清除能力時，過量的ROS可以導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA損傷及線粒體損傷等[14]。胰島β細(xì)胞表面抗氧化酶的含量低，使其對氧自由基的攻擊更加敏感，容易導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體損傷[15]。Fenton反應(yīng)所需要的鐵主要來源于LIP，而線粒體是利用鐵的主要細(xì)胞器，用于酶和ATP的合成，線粒體LIP是最大的胞內(nèi)LIP之一，因此線粒體與鐵依賴的ROS產(chǎn)生有著非常密切的關(guān)系。本研究顯示隨著鐵濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，線粒體膜電位下降，線粒體結(jié)構(gòu)明顯受損，甚至失去完整的結(jié)構(gòu)，而損壞的線粒體又釋放更多的ROS，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞死亡，形成惡性循壞。線粒體既是氧化應(yīng)激的主要來源又是氧化應(yīng)激的靶向細(xì)胞器，能夠敏感地感受到機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的水平變化，即使在相對低水平的鐵濃度所產(chǎn)生的ROS，也會導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而出現(xiàn)胰島β細(xì)胞死亡。線粒體損傷后，線粒體LIP大量釋放，繼而催化Fenton反應(yīng)生成更多的ROS。新近研究顯示ROS也對胰島β細(xì)胞的分泌功能有重要影響[16]。因此鐵過載導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭中，線粒體損傷可能起著關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究通過探索同F(xiàn)AC濃度下LIP水平及細(xì)胞生長情況，成功建立胰島β細(xì)胞慢性鐵過載模型，為今后進(jìn)一步研究鐵過載對胰島細(xì)胞的直接損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在胰島β細(xì)胞數(shù)目衰竭和分泌功能障礙的過程中，伴隨大量ROS產(chǎn)生及線粒體損傷。未來需要深入研究鐵過載導(dǎo)致胰島β細(xì)胞死亡的確切機(jī)制及對其進(jìn)行干預(yù)，協(xié)助胰島β細(xì)胞應(yīng)對過量的ROS，減少線粒體損傷。這有可能成為緩解胰島β細(xì)胞衰減的重要環(huán)節(jié)，也為解決鐵過載所致的胰島β細(xì)胞損傷提供了一個新的切入點。