施黎銀， 周 輝， 趙 明△

(1南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室, 廣東 廣州 510515； 2南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510630)

當今，心血管疾病逐年增高并越來越年輕化，而動脈粥樣化則是心腦血管疾病的病理基礎。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制至今仍在探索中，有多種學說從不同角度對它進行了闡述。近年來，越來越多的研究證明動脈粥樣硬化是一種多因素作用的自身免疫性疾病，天然免疫和獲得性免疫均參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程[1]。有研究發(fā)現(xiàn)[2]多種自身抗原參與了動脈粥樣硬化的形成。目前已證實的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)是動脈粥樣硬化形成過程中的重要抗原，具有高免疫原性，可以刺激機體產(chǎn)生ox-LDL抗體。LDL在致氧因子的作用下氧化形成ox-LDL，ox-LDL刺激巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白，進而堆積形成泡沫細胞。ox-LDL引起的炎癥反應還可以引起血管內(nèi)皮細胞功能紊亂，從而刺激中膜平滑肌細胞及肌源性泡沫細胞遷移至內(nèi)膜，結合單核細胞上的Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TRL4)，激活單核細胞，導致大量泡沫細胞的形成[3]，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。

大量實驗表明ox-LDL刺激機體產(chǎn)生的ox-LDL抗體[4]與動脈粥樣硬化進展有關。研究人員在雄性動脈粥樣硬化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了ox-LDL抗體的滴度與動脈粥樣硬化的進展呈正相關。第1個被發(fā)現(xiàn)的是E06(一個鼠IgM單克隆抗體)，其次是鼠單克隆IgG MDA2抗體[5]，經(jīng)過MRI的檢查，均證實了該抗體在動脈粥樣硬化過程中確實起到了保護性作用。因此，用抗體來治療動脈粥樣硬化成為一個新的研究方向。

目前篩選人源抗體應用最廣泛的技術包括噬菌體抗體展示技術[6]和哺乳動物細胞展示技術，噬菌體展示技術主要是將抗體融合在絲狀噬菌體(filamentous phage)的外殼蛋白上，使抗體能夠表達在噬菌體顆粒表面。通過數(shù)輪對抗體的篩選和富集，即可獲得針對特定抗原的特異性單克隆抗體。但是，噬菌體展示技術不能篩選出全長抗體，只能得到例如抗原結合片段(fragment of antigen binding, Fab)或單鏈可變區(qū)抗體片段(single chain variable fragment, scFv)等抗體片段[7]。而且抗體的表達和修飾過程是在細菌中進行，如果將獲得的抗體基因轉入哺乳動物細胞，抗體要么無法表達，要么表達量極低。近年來，越來越多的研究鎖定在利用哺乳動物細胞表面展示系統(tǒng)來獲得人源抗體[8]，它主要通過跨膜序列將全長抗體展示在細胞表面，從而可以通過流式細胞儀進行高通量篩選得到與抗原結合的抗體。所以，應用哺乳動物細胞表面展示系統(tǒng)可展示全長人源抗體，篩選得到的抗體的空間結構與天然抗體結構更為接近，全長雙價抗體也可發(fā)揮抗體恒定區(qū)的效應功能[9]。因此，本研究旨在構建一個大容量的動脈粥樣硬化抗體細胞庫，以此篩選得到具有治療作用的特異性的動脈粥樣硬化抗體。

材 料 和 方 法

1 材料

本文中的外周血來自廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科12名年齡大于60歲的動脈粥樣硬化患者，這12名均為已確診且需要行血管成形術和支架植入術的患者。載體pcDNA5/FRT、LipofectamineTM2000和Flp-InTM-CHO(FCHO)細胞購自Invitrogen;RNA提取試劑盒和DH5 α化學感受態(tài)細胞購買自北京天根生物技術有限公司；藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標記的鼠抗人Kappa 鏈抗體購自BD，DMEM和血清購自HyClone，淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司，Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶SfiI、BsmB I購自NEB；逆轉錄酶和T4 DNA連接酶購自Promega；質粒DNA回收試劑盒和DNA純化試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；Hanm's-F 12培養(yǎng)基購自Life Technologies。

2 載體

載體pcDNA5/FRT包括CMV啟動子，F(xiàn)LP重組酶(flippase，F(xiàn)lp)識別位點(flippase recognition target, FRT)，氨芐青霉素(ampicillin，Amp)和潮霉素(Hygromycin, hygro)抗性基因，見圖1。

Figure 1. Vector of pcDNA5/FRT.

3 方法

3.1分離外周血單個核細胞(peripheral blood mono-nuclear cells, PBMC) 抽取12名動脈粥樣硬化患者靜脈血分離PBMC并提取總RNA(參照說明書操作)，以總RNA為模板，設計特異性引物[10]逆轉錄合成cDNA第1鏈。

3.2構建初級庫載體及二級庫雙表達載體pcDNA-DHL

3.2.1構建載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK 首先PCR擴增重鏈及跨膜序列(VH-TM)和輕鏈全長(CK),再用限制性內(nèi)切酶XhoI和NheI酶切載體pcDNA5/FRT，利用重疊重組法分別將酶切后的載體和擴增片段拼接形成新的載體。將上述連接體系轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，克隆鑒定后，分別命名為pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，提質粒保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2二級庫雙表達載體pcDNA-DHL構建及驗證 以載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK分別為模板，利用PCR擴增出完整的HC-TM表達框、載體骨架和完整的Kappa表達框，通過重疊重組，轉化，構建出雙表達載體pcDNA-DHL，見圖2。將瞬時轉染質粒pcDNA-DHL的細胞作為陽性對照，將僅轉染pcDNA5-CK的細胞作為陰性對照，將不轉染質粒DNA的作為空白對照。同時共轉染質粒pcDNA5-VH-TM + pcDNA5-CK的細胞作為陽性對照轉染293F細胞。

Figure 2.Vector of pcDNA5-DHL.

3.3 構建動脈粥樣硬化抗體基因庫pDHL-As

3.3.1構建動脈粥樣硬化全人源初級重鏈抗體庫pcDNA-vh和初級輕鏈抗體庫pcDNA-ck 以cDNA第1條鏈為模板，用相應引物PCR擴增抗體全套Kappa輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。用限制性內(nèi)切酶AgeI和XhoI酶切輕鏈全長基因的擴增產(chǎn)物及載體pcDNA5-CK，回收酶切后片段，用T4 DNA連接酶按3∶1 比例混合連接，在16 ℃反應24 h后導入感受態(tài)DH5α，構建輕鏈基因初庫pcDNA-ck。將轉化后的細菌倍比稀釋，均勻涂在含100 mg/L 氨芐青霉素的LB固體平皿上，倒置于37 ℃孵箱12～18 h，計數(shù)平皿上的菌落數(shù)，并計算出輕鏈的庫容量。將平皿上的所有菌落收集起來，即為輕鏈抗體基因庫。以同樣的方法構建重鏈基因初庫pcDNA-vh。分別從重、輕鏈抗體庫中各挑50個單克隆擴大培養(yǎng)，小提質粒，送華大基因測序并軟件分析序列。

3.3.2動脈粥樣硬化二級抗體基因庫pDHL-As的構建 用內(nèi)切酶SfiI酶切后可用于插入抗體輕鏈的全長基因片段，用BsmB I酶切后可用于插入抗體重鏈的可變區(qū)基因片段。同時以BsmB I和SfiI對載體pcDNA-DHL進行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并分離純化5 kb和3 kb的兩段目的片段。再用SfiI和BsmB I分別對前面制備好的輕鏈和重鏈基因初庫進行酶切，進行DNA的凝膠電泳分離純化備用。將上面獲得的2個載體片段、1個輕鏈全長片段和1個重鏈可變區(qū)片段按1 ∶1 ∶ 3 ∶3分子比例混合，用T4DNA連接酶，16 ℃連接24 h，將連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)細菌DH5α，轉化后的細菌接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB固體平皿上，倒置于37 ℃孵箱12～18 h，計數(shù)平皿上的菌落數(shù)，并計算出庫容量。

3.3.3抗體基因穩(wěn)定轉染Flp-InTM-CHO細胞 將處于對數(shù)生長期的Flp-InTM-CHO細胞以每孔5×105個的密度接種于6孔板中，12 h后換新鮮培養(yǎng)基。4 μg混合質粒(0.4 μg PDHL質粒+3.6 μg poG44質粒加入250 μL opti-MEM培養(yǎng)基中，充分混勻后往里加8 μL LipofectamineTM2000脂質體，混勻室溫放置20 min，將混合物加入對應的6孔板中，4 h后換液并培養(yǎng)48 h，加入含500 mg/L潮霉素培養(yǎng)基加壓篩選，每2天換1次液，篩選2周后收集生長狀態(tài)好的活細胞保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4抗ox-LDL抗體的篩選及初步鑒定 我們選擇ox-LDL作為抗原來篩選出特異性抗體。根據(jù)FITC標記試劑盒的說明書，用FITC標記ox-LDL，常規(guī)培養(yǎng)動脈粥樣硬化抗體細胞庫，用不含胰酶的細胞消化液進行消化回收后用PE標記鼠抗人抗體和FITC標記ox-LDL進行雙染，隨后經(jīng)流式細胞分選儀檢測、分選表達抗ox-LDL抗體的FCHO細胞。

結 果

1 外周血單個核細胞總RNA的提取

抽取動脈粥樣硬化患者的外周血，經(jīng)淋巴細胞分離液分離出PMBC。按TRIzol試劑說明書操作，提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性，做了3個批次，可見3條清晰的28 s、18 s和5 s條帶，說明提取的總RNA完整性較好，見圖3。

Figure 3.Total RNA extracted from PBMCs.Three different batches. M: Marker; 1～3: 3 different batches.

2 PCR擴增重鏈及跨膜序列(VH-TM)片段和輕鏈全長(CK)

PCR擴增得到的VH-TM長約為1 600 bp， CK約為800 bp左右，分別連接至載體pcDNA-FRT，構建載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，見圖4。

Figure 4.PCR results for constructed fragmentVH-TM and fragment CK. A: 1～4 PCR amplification of the genes fragment of VH-TM；B: 1～6 PCR amplification of the genes fragment of CK. M: marker.

3 雙表達載體pcDNA-DHL的酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶sfiI、BsmB I酶切驗證重組載體pcDNA-DHL是否正確，酶切后片段大小各為800bp、4 900 bp、400 bp、2 700 bp，見圖5。

Figure 5.The vector pcDNA-DHL digested by Sfi I and BsmB I. We get four fragments. M: Marker; 1～2: two identical samples.

4 二級雙表達載體pcDNA-DHL在293F細胞表面展示

雙表達抗體基因庫(pcDNA-DHL)轉染293F細胞，使用流式細胞儀分析全長抗體庫在293F細胞表面的展示，結果顯示，用pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK共轉染的293F細胞可以檢測到陽性細胞總量為27%，見圖6B，轉染了pcDNA-DHL的293F細胞可以檢測到陽性細胞總量為39.2%，見圖6D。說明全長抗體可以成功地展示在293F細胞的表面。

Figure 6.FACS analysis of antibody library expression on 293F cell surface.A: negative control (non- transfected 293F cells); B:positive control (pcDNA5-VH-TM and pcDNA5-CK co-transfected 293F cells); C: 293F cells transfected with pcDNA5-CK and labeled with PE-Kappa；D: 293F cells transfected with pcDNA-DHL and labeled with PE-Kappa.

5 抗體基因的擴增

將重鏈可變區(qū)(VH)產(chǎn)物和輕鏈(CK)基因產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳中可見約0.38 kb的重鏈可變區(qū)條帶和0.70 kb Kappa輕鏈條帶，為目標條帶，見圖7。

Figure 7.PCR amplification of the genes encoding the light and heavy chains of human antibodies. A: heavy chain variable region; B: Kappa chain. 1～7: 7 different batches. M： Marker.

6 輕、重鏈抗體初庫的構建，庫容量的計算與測序結果分析

將酶切后的重、輕鏈PCR產(chǎn)物，分別插入載體pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK，并導入感受態(tài)DH5α。計數(shù)在帶有氨芐青霉素抗性的LB固體平皿上的菌落數(shù)，即可計算出所構建的抗體基因初庫容量。結果顯示，重鏈基因初庫容量為1.79×105，輕鏈基因初庫容量為1.80×105。分別隨機挑選出50個輕鏈單克隆和50個重鏈單克隆，進行測序分析。再分別從重鏈輕鏈的50個克隆中挑選出20個測序結果分析，結果如圖所示，20個重鏈克隆中有16個克隆含有正確的閱讀框架；20個輕鏈克隆有18個克隆含有正確的閱讀框架。理論上抗體庫多樣性為2.32×1010[(1.79×105×80%)×(1.8×105×90%)]，見圖8。

Figure 8.Analysis for the sequences of the regions of the healy chains (A) and light chains (B).

7 動脈粥樣硬化抗體基因庫的構建

酶切后的重、輕鏈初庫產(chǎn)物，酶切后的載體pcDNA-DHL片段，利用四片段連接法連接后，轉化入感受態(tài)DH5α。計數(shù)在含有氨芐青霉素抗性的LB固體平皿上的菌落數(shù)，即可獲得所構建的抗體基因庫容量。結果顯示雙表達抗體基因庫容量為1.81×105。

8 全長抗體在Flp-InTM-CHO細胞表面的表達

將抗體庫質粒DNA與質粒poG44共轉染Flp-InTM-CHO細胞，然后用流式細胞儀分析抗體在Flp-InTM-CHO表面的表達情況，結果顯示，17.1%的細胞表面可檢測到抗體的表達，見圖9。

Figure 9.Flow cytometry for detecting the expression of human antibodies on Flp-InTM-CHO cell surface.

9 抗ox-LDL抗體的篩選及初步鑒定

用PE標記的鼠抗人抗體和FITC標記的ox-LDL進行雙染，隨后經(jīng)流式細胞分選儀分選出45個表達抗ox-LDL抗體的FCHO細胞，見圖10。

Figure 10.The PE and FITC double positive cells were sort by flow cytometry. A: control; B: treatment.

討 論

血管內(nèi)的免疫反應可致動脈粥樣硬化發(fā)生已被廣泛接受，科學家們便研究是否可以利用這方面的知識來開發(fā)治療心血管疾病的新方法。ox-LDL也成為研究熱門的靶點之一，其中之前研究較為深入的ox-LDL治療抗體BI-206，已在小鼠[11]和恒河猴[12]等動物模型中展示了對動脈粥樣硬化的良好治療效果，但在2015年的二期臨床試驗(使用)結果中卻無明顯療效。其中的潛在的原因可能是因為這個抗體是在從單鏈抗體噬菌體庫(n-CoDeR)篩選出來的，使用的是噬菌體展示技術。由于篩選過程是在細菌中進行，原核表達和哺乳動物細胞中表達存在一定差異，抗體的空間結構未必與天然抗體結構相似，故篩選出的抗體在后續(xù)應用中可能存在一定劣勢。哺乳動物細胞表面展示系統(tǒng)可展示全長人源抗體，篩選到的抗體空間結構與天然抗體結構更為接近，在動物、臨床研究中的治療效果應該更具優(yōu)勢，故本研究使用哺乳動物細胞表面展示系統(tǒng)篩選ox-LDL抗體。

為保證抗體庫的特異性，選擇的PBMCs來源于大于60歲的動脈粥樣硬化患者外周血。其次，為保證PBMCs中抗體基因的完整性，減少特異性抗體基因的丟失，提取RNA后檢測RNA質量符合要求方可進入后續(xù)實驗。此外構建雙啟動子表達載體pcDNA-DHL的目的是一次性同時轉入輕鏈和重鏈載體，減少因多次轉染導致的同一個CHO細胞同時轉入多個輕鏈載體或重鏈載體。本研究通過改造載體pcDNA5-FRT，使得我們構建的二級雙表達載體上帶有FRT位點和潮霉素抗性基因。我們同時轉染pcDNA5/FRT和poG44兩個質粒，poG44會表達Flp重組酶，pcDNA5/FRT帶有目的基因。在Flp重組酶的催化下，pcDNA5/FRT上的FRT位點和染色體上已經(jīng)存在的FRT位點發(fā)生重組，將質粒上的目的基因重組到細胞染色體上，從而實現(xiàn)目的基因的組成型表達。經(jīng)過潮霉素的篩選和淘汰[13]，從而實現(xiàn)一個細胞展示一種抗體。雙表達載體pcDNA-DHL中抗體基因表達結構包含啟動子、FLP重組酶識別位點FRT及血小板衍生生長因子受體跨膜序列(plateletderived growth factor receptor trans- membrane,PDGFR-TM)。載體重鏈尾部加上跨膜序列TM，使抗體可以展示在細胞膜表面。再用流式進行抗體庫的篩選，抗輕鏈抗體標記，即可獲得全長抗體在細胞表面的表達情況[14]。

利用此抗體庫，用ox-LDL作為抗原，篩選出了45個跟ox-LDL親和力高的細胞，接下來，我們將從這45個細胞里篩選出可穩(wěn)定表達抗體的單克隆細胞株，擴大培養(yǎng)，表達抗體，以供后續(xù)的細胞和動物實驗。由于抗體片段與載體連接效率，細菌轉化效率，細胞轉染效率等步驟的實際操作存在限制，導致抗體庫的容量局限在105左右，因而，本研究可以選擇電轉化來提高轉化效率，在現(xiàn)有的基礎上提高連接效率等，篩選出更大庫容量的抗體庫。