劉興梅， 張瑩瑩， 王圓圓， 石明雋， 肖 瑛， 張 帆， 郭 兵△

(1貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽 550004； 2貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因[1-3]。隨著病情進(jìn)展則發(fā)生腎間質(zhì)纖維化。而DN發(fā)病過程中，Notch信號(hào)通路可通過調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腎臟損傷[4]。Notch通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和自噬過程。自噬是蛋白質(zhì)在膜包囊泡中降解的生物學(xué)過程，通過對(duì)受損細(xì)胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞的完整性[5]。研究表明[6]，體外高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞自噬被抑制，小管上皮細(xì)胞清除細(xì)胞外基質(zhì)的能力降低，進(jìn)而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。可見，自噬與DN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而，Notch信號(hào)通路與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡對(duì)腎臟纖維化影響的具體作用機(jī)制不甚清楚。因此本研究擬采用db/db糖尿病小鼠模型檢測(cè)Notch1通路對(duì)db/db小鼠腎臟組織自噬水平的影響以及對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的調(diào)控，以期為糖尿病腎病的防治提供新的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周雄性db/db和db/m小鼠，SPF級(jí)，體重20±2 g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)為SCXK[蘇]2015-0001。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 ClarityTMWestern ECL substrate (BIO-RAD)；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑 (中杉金橋)；DAB顯色劑 (博士德生物工程有限公司)；小鼠抗β-actin抗體 (普美生物)；兔抗Notch1 (#3608)、LC3-Ⅰ/-Ⅱ (#12741)、phospho-Akt (Thr308)(#13038)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白[phosphorylated mammalian target of rapamycin，phospho-mTOR (Ser2448)](#2971)抗體均購(gòu)自CST；兔抗第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)(ab32199)、p62 (ab109012)、 Akt (ab179463)、mTOR (ab32028)抗體購(gòu)自Abcam； 兔抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ, Col-Ⅰ)抗體(Proteintech, 14695-1-AP)；兔抗Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ, Col-Ⅲ)抗體(Sigma, SAB4500367)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。 C57BL/KsJ db/db(約6周齡)雄性小鼠和年齡匹配的db/m小鼠由南京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d以適應(yīng)新環(huán)境。動(dòng)物飼養(yǎng)條件控制于溫度(20～25 ℃)，相對(duì)濕度(50%～60%)和12 h光/暗循環(huán)。給動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。將小鼠隨機(jī)分為db/m對(duì)照組和db/db實(shí)驗(yàn)組(每組8只小鼠)。給所有小鼠提供正常飲食和無限量飲用水。飼養(yǎng)12周后腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，摘眼球取血，分離血清凍存，用于生化指標(biāo)檢測(cè)；頸椎脫臼處死小鼠，取左腎中段1/3腎固定于4%多聚甲醛，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；余下腎于-80 ℃保存用于Western blot檢測(cè)。

2.2生化指標(biāo)的檢測(cè) 己糖激酶法檢測(cè)血糖(blood glucose,BG)，高效液相色譜法檢測(cè)糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)，酶法檢測(cè)血清肌酐(serum creatinine,SCr)和甘油三酯(triglyceride，TG)，膽固醇氧化酶法檢測(cè)血總膽固醇(total cholesterol,TC)。

2.3腎組織形態(tài)學(xué)的觀察 HE和Masson染色后，光鏡觀察腎組織病理變化。

2.4免疫組織化學(xué)染色 在抗原修復(fù)和阻斷后，將切片在室溫下與Notch1單克隆抗體的最佳稀釋液一起溫育24 h。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌切片后，加入抗兔 II 抗1 h。然后用PBS洗滌切片，用ABC試劑盒孵育30 min，用DAB顯色，并用蘇木精復(fù)染。

2.5Western blot檢測(cè)蛋白水平 從腎組織中分離提取蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到膜上，將膜在4 ℃下與兔抗Notch1(1∶1 000)、PTEN(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)，P62(1∶1 000)、Ⅰ型膠原蛋白(1∶1 000)和Ⅲ型膠原蛋白(1∶800)單克隆抗體，以及小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶4 000)單克隆抗體孵育過夜。 用含有0.1% Tween-20(TBST)的Tris緩沖液重復(fù)洗滌膜，用Tris緩沖液(TBS)洗滌1次，然后用 II 抗孵育1 h。加入ClarityTMWestern ECL底物(BIO-RAD)以顯現(xiàn)免疫染色的蛋白質(zhì)。對(duì)于定量測(cè)定，通過ImageJ軟件分析條帶灰度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且通過方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生化指標(biāo)的變化

與db/m小鼠比較，db/db小鼠的血糖、糖化血紅蛋白、血清肌酐、甘油三酯和膽固醇均明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 db/m和db/db小鼠生化指標(biāo)的變化

2 小鼠腎組織病理變化

2.1HE染色 HE染色可見db/m組腎小管結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞形態(tài)正常，間質(zhì)無水腫，db/db組腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，見圖1。

Figure 1.Histological changes of the renal tissues in the db/m and db/db mice were observed with HE staining. a: renal tubular expansion; b: vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells.

2.2Masson染色 Masson染色后，膠原纖維和胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)和紅細(xì)胞呈紅色。結(jié)果顯示，db/m組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球基底膜和間質(zhì)無膠原纖維堆積；與db/m組相比較，db/db組腎臟組織可見大量膠原纖維樣物質(zhì)沉積于腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)和腎間質(zhì)，腎小管結(jié)構(gòu)排列紊亂，見圖2。

Figure 2.The histological changes of the renal tissues in the db/m and db/db mice were observed with Masson staining. a: collagenous fiber-like substance deposition in the glomerular capillaries; b: collagenous fiber-like substance deposition in the glomerular basement membrane; c: collagenous fiber-like substance deposition in the renal interstitium; d: disarrangement of tubular structure.

3 小鼠腎組織中自噬和纖維化指標(biāo)的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與db/m組比較，db/db組的LC3-Ⅱ表達(dá)減少(P<0.05)，P62表達(dá)明顯增加(P<0.01)；Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表達(dá)明顯增多(P<0.01),見圖3。

Figure 3.Western blot was used to determine the protein levels of LC3, P62, Col-I and Col-III in the renal tissues of db/m and db/db mice. Mean±SD. n=8. *P<0.05, **P<0.01 vs db/m.

4 小鼠腎組織中PTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR的蛋白水平變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與db/m組比較，db/db組的PTEN蛋白水平明顯減少(P<0.01)，p-Akt(Thr308)和p-mTOR(Ser2448)的蛋白水平明顯增加(P<0.01)，而兩組總Akt和mTOR蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 4.Western blot was used to determine the protein levels of PTEN, p-Akt (Thr308), Akt, p-mTOR (Ser2448) and mTOR in the renal tissues of db/m and db/db mice. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs db/m.

5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠腎組織Notch1的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色直觀檢測(cè)Notch1蛋白的表達(dá)位置和表達(dá)量，顯微鏡下可見蛋白陽性結(jié)果呈棕黃色顆粒，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。結(jié)果顯示，db/m組的Notch1在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球中表達(dá)不明顯；與db/m組比較，db/db組Notch1在腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)，在腎小球也有少量表達(dá)，見圖5。

Figure 5.The Notch1 expression in the renal tissues in the db/m and db/db mice was detected by immunohistochemical staining (shown by “a” and arrows).

6 小鼠腎組織Notch1的表達(dá)變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與db/m組比較，db/db組Notch1蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Western blot was used to determine the protein level of Notch1 in the renal tissues of db/m and db/db mice. Mean±SD. n=8. **P<0.01 vs db/m.

7 小鼠腎組織Notch1和PTEN蛋白的相關(guān)性分析

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與db/m組比較，db/db組Notch1的蛋白表達(dá)明顯增加而PTEN的蛋白表達(dá)降低。利用Pearson相關(guān)分析評(píng)估兩者之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，小鼠腎組織Notch1蛋白與PTEN蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.685，P<0.05)，見圖7。

討 論

Notch信號(hào)通路是一條影響細(xì)胞命運(yùn)、保守而重要的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在哺乳動(dòng)物中由4種受體(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)、經(jīng)典配體和非經(jīng)典配體構(gòu)成[7]，Notch1在維持腎小管上皮細(xì)胞功能中扮演著重要角色[8]。近年來，研究表明激活Notch信號(hào)通路可通過加重氧化應(yīng)激進(jìn)一步使DN腎纖維化加劇[9]。Tian等[10]又報(bào)道，Notch誘導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路的激活，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化、DN腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程?？梢?，Notch可通過各種不同機(jī)制參與DN纖維化過程。本實(shí)驗(yàn)中db/db小鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，大量膠原纖維樣物質(zhì)沉積于腎小球基底膜和腎間質(zhì)，Notch1、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白水平明顯增加，表明Notch1增加加重了DN腎小管間質(zhì)纖維化過程。

有研究表明[11]，Notch信號(hào)通路與自噬能調(diào)節(jié)足細(xì)胞分化，當(dāng)Notch通路異常激活時(shí)，增加自噬水平可減少足細(xì)胞分化，減輕足細(xì)胞損傷，緩解腎臟功能障礙。還有研究表明[12]，在高糖環(huán)境中，激活Notch1使足細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡與自噬之間的平衡破壞，影響足細(xì)胞功能恢復(fù)。說明，腎臟內(nèi)Notch信號(hào)通路的激活影響細(xì)胞自噬水平，進(jìn)而使足細(xì)胞功能障礙。自噬是進(jìn)化上保守，通過溶酶體降解受損細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，消除細(xì)胞毒性蛋白聚集體，使細(xì)胞能夠循環(huán)利用線粒體的能源并維持細(xì)胞存活[13]。因此，自噬與腎臟病之間的關(guān)系逐漸成為研究的熱點(diǎn)。自噬對(duì)維持細(xì)胞功能起重要作用，自噬異常則導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。而腎間質(zhì)纖維化是DN發(fā)展過程中主要的病理特征之一，自噬也參與其中[14]。mTOR信號(hào)通路是負(fù)性調(diào)節(jié)自噬的重要機(jī)制[15]。mTOR被抑制時(shí)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，相反，作為一種關(guān)鍵的反饋機(jī)制，mTOR的再激活則進(jìn)一步抑制自噬并啟動(dòng)溶酶體重組[16]。本研究提示，db/db小鼠腎組織中LC3蛋白水平較db/m組減少，P62、p-Akt(Thr308)和p-mTOR(Ser2448)蛋白水平比db/m組明顯增加，自噬被抑制，Akt/mTOR信號(hào)通路激活，并且伴隨Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的大量沉積。自噬受Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)[17]。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因[18]。PTEN具有很強(qiáng)的抑癌及調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能，作為脂質(zhì)磷酸酶，負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路[19]。有研究報(bào)道，miR-4465通過抑制PTEN的蛋白表達(dá)，上調(diào)磷酸化的Akt，從而激活mTOR并抑制自噬，進(jìn)而影響肝癌的發(fā)生[20]。在前列腺癌中，miR-146b也通過靶向調(diào)控PTEN，激活A(yù)kt / mTOR信號(hào)通路使自噬被抑制，參與前列腺癌的發(fā)生[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，Notch1是否通過自噬促進(jìn)糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，實(shí)驗(yàn)中觀察到db/db小鼠腎組織中PTEN蛋白表達(dá)明顯減少，Notch1與PTEN呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而抑制自噬，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。