王東娟， 李恒棟， 謝小玲， 李立成

(中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院心內(nèi)科， 浙江 寧波 315010)

心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者死亡的主要原因之一，引起糖尿病心血管并發(fā)癥的機制包括心肌間質(zhì)纖維化、心肌能量代謝異常以及心肌微血管病變等[1]。已有研究證實，糖尿病心肌微血管損傷早于大血管及心肌細胞，與糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是目前尚無有效的控制或逆轉(zhuǎn)心肌微血管損傷的手段[2]。胰高血糖素樣肽1(glucagan-like peptide-1, GLP-1)是由空、回腸上皮L細胞分泌的一種小分子多肽，研究表明除了降血糖作用外，GLP-1還具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎性因子釋放和抗凋亡等多種生物學(xué)保護作用。

GLP-1的心血管保護作用受到了越來越多的關(guān)注，給予心衰大鼠GLP-1干預(yù)，可通過GLP-1受體(GLP-1 receptor, GLP-1R)介導(dǎo)下游信號通路抑制心室重塑[3]；在缺血再灌注大鼠模型，給予GLP-1處理可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕缺血再灌注損傷[4]，提示GLP-1發(fā)揮心血管保護作用的重要機制之一即抗氧化應(yīng)激作用。氧化應(yīng)激損傷是糖尿病多種并發(fā)癥的統(tǒng)一機制。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1, Keap1)-核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)信號通路是機體重要的抗氧化應(yīng)激信號通路，可通過調(diào)節(jié)下游信號分子發(fā)揮抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，激活Keap1-Nrf2信號通路對多種糖尿病相關(guān)并發(fā)癥有益，如糖尿病腎病、糖尿病神經(jīng)病變以及糖尿病視網(wǎng)膜病變等[5]。但是GLP-1調(diào)控Keap1-Nrf2信號通路發(fā)揮糖尿病心肌微血管的保護作用尚無文獻報道。因此，本項工作建立糖尿病大鼠模型，擬通過體內(nèi)和體外實驗，明確GLP-1對糖尿病大鼠心肌微血管的保護作用，并進一步探討其保護作用是否通過Keap1-Nrf2信號通路介導(dǎo)。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級雄性6～8周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重160～220 g，18只用于動物實驗，22只用于心肌微血管內(nèi)皮細胞原代分離培養(yǎng)。由寧波大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SYXK(浙)2019-0005。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)購自Sigma；GLP-1和GLP-1類似物艾塞那肽(exenatide)購自Tocris；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自HyClone；體外血管通透性測定試劑盒購自Chemicon；超氧化物檢測試劑盒和超氧化物陰離子熒光探針二氫乙啶(dihydroethidium, DHE)購自碧云天生物技術(shù)公司；GLP-1R抗體和Nrf2 siRNA購自Santa Cruz；抗Keap1、Nrf2、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)和β-actin抗體購自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1糖尿病大鼠模型構(gòu)建[6]將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液中，配制成0.25%的STZ注射液。大鼠腹腔注射STZ注射液(35 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)3 d；尾靜脈取血測量血糖，若3次隨機血糖≥16.7 mmol/L，認為糖尿病大鼠建模成功。將糖尿病大鼠隨機分為2組：DM組(n=6)，予以糖尿病大鼠腹腔注射生理鹽水；DM+exenatide組(n=6)，予以糖尿病大鼠腹腔注射艾塞那肽0.25 μg/kg，每天2次，連續(xù)干預(yù)3個月。以年齡、性別匹配的正常SD大鼠作為對照組(n=6)，干預(yù)前后檢測各組大鼠體重、血糖、血壓等變化。

3.2透射電鏡檢測心肌微血管通透性 硝酸鑭是直徑約4 nm的重金屬顆粒，生理狀態(tài)下不可穿越細胞連接，因此可通過硝酸鑭灌注法評估心肌微血管通透性變化。采用改良Krebs-Henseleit溶液配制二甲砷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)，再利用二甲砷酸鈉緩沖液配置2%硝酸鑭灌流液[6]。采用Langendorff裝置，取硝酸鑭灌流液以生理壓力灌流各組大鼠心臟20 min。取左心室組織，常規(guī)戊二醛固定、包埋、切片，透射電鏡下通過觀察硝酸鑭的積聚部位評估心肌微血管通透性變化。

3.3心肌微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng) 0.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，無菌條件下取左室，以75%乙醇浸泡去除心內(nèi)外膜，然后將心肌組織剪成小組織塊。0.2% Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴消化5 min；0.25%胰酶，37℃水浴消化5 min；然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。室溫下230 r/min離心10 min，棄上清，將細胞重懸于含15% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后換液去除未貼壁細胞，24 h后再次換液，以后每3 d換液1次。細胞生長至80%融合后消化傳代，第2～3代細胞用于進一步實驗[7]。心肌微血管內(nèi)皮細胞分為以下3組[6]：正常對照(control)組，培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.5 mmol/L； 高糖(high glucose，HG)組，培養(yǎng)液葡萄糖濃度為25 mmol/L；GLP-1處理組(HG+GLP-1組)，培養(yǎng)液葡萄糖濃度為25 mmol/L，予以GLP-1(10-8mol/L)預(yù)處理。按照說明書，以si-Nrf2轉(zhuǎn)染心肌微血管內(nèi)皮細胞抑制Nrf2表達，以scrambled siRNA(NC-siRNA)作為陰性對照。

3.4單層心肌微血管內(nèi)皮細胞通透性檢測 取生長狀態(tài)良好的心肌微血管內(nèi)皮細胞，以每孔2×105的濃度接種于體外血管通透性測定試劑盒。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細胞生長融合至80%左右時，將通透性物質(zhì)FITC-dextran(FITC標記的葡聚糖，終濃度1 g/L)加入試劑盒內(nèi)池，室溫放置10 min，收集外池培養(yǎng)液，采用分光光度儀檢測各組培養(yǎng)液熒光強度，并分析各組內(nèi)皮細胞通透性變化。

3.5活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測 采用超氧化物檢測試劑盒檢測ROS生成。取第2～3代心肌微血管內(nèi)皮細胞接種于96孔板，待細胞生長融合至80%左右時，吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗1次。每孔加入200 μL超氧化物檢測工作液，37 ℃孵育3 min；按照預(yù)先分組處理各組細胞后，在450 nm測定吸光度(A值)。

3.6超氧化物陰離子檢測 采用DHE法檢測超氧化物陰離子生成。取第2～3代心肌微血管內(nèi)皮細胞接種于蓋玻片，待細胞貼壁后，按照預(yù)先分組處理各組細胞。以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解DHE，然后將DHE溶液加入細胞培養(yǎng)液中(終濃度為5 μmol/L)，孵育約30 min。將細胞爬片取出，PBS沖洗后，DAPI染核。激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長535 nm)下觀察各組細胞超氧化物陰離子變化。

3.7Western blot 各組細胞按照預(yù)先分組處理后，分別提取核蛋白和總蛋白；采用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白含量。配制SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，蛋白(20 μL)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉。加入I抗(GLP-1R、Keap1、Nrf2、HO-1和β-actin)4℃孵育過夜；洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的II抗，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑滴膜，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，測定條帶積分灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)或t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠一般情況比較

糖尿病大鼠建模成功后，給予生理鹽水或艾塞那肽干預(yù)3個月。干預(yù)前后檢測各組大鼠體重、血糖和血壓等變化。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，糖尿病組(生理鹽水干預(yù))大鼠血糖顯著升高(P<0.05)，體重顯著降低(P<0.05)，血壓無顯著變化；予以小劑量艾塞那肽干預(yù)后，與生理鹽水干預(yù)組相比，體重、血壓和血糖水平無顯著性變化，見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較

2 艾塞那肽改善糖尿病大鼠心肌微血管通透性

正常對照組大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞連接完整，未見硝酸鑭顆粒穿透基底膜；在糖尿病組大鼠，可見硝酸鑭顆粒透過內(nèi)皮細胞侵入基底膜及周圍組織；而給予艾塞那肽干預(yù)后，可見大部分硝酸鑭顆粒位于管腔和管壁，少部分位于基底膜，見圖1。

Figure 1.Effects of exenatide on cardiac microvascular permeability observed under transmission electron microscope. The scale bar=1 mm. Lanthanum nitrate is highlighted with yellow arrows.

3 心肌微血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)

心肌微血管內(nèi)皮細胞采用酶消化法體外分離培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天時，細胞趨于伸展，呈多角形、近圓形或梭型，見圖2A；培養(yǎng)至第7天時，呈典型“鋪路石樣”生長，見圖2B。采用Western blot法檢測觀察到心肌微血管內(nèi)皮細胞表達GLP-1R，見圖2C。

Figure 2.Characterization of cardiac microvascular endothelial cells (CMECs) and detection of GLP-1R expression. A: CMECs cultured for 3 d. B: CMECs cultured for 7 d. The scale bar=40 μm.C: GLP-1R expression detected by Western blot. Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs negative group.

4 GLP-1改善高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞通透性損傷

與對照組相比，高糖作用下FITC-dextran滲透顯著增多(P<0.01)，而GLP-1干預(yù)后FITC-dextran滲透顯著減少(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of GLP-1 on high glucose (HG)-induced permeability of cardiac microvascular endothelial cells.Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs HG+vehicle group.

5 GLP-1抑制高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞ROS生成

通過DHE染色觀察到，與對照組比較，高糖處理組心肌微血管內(nèi)皮細胞熒光強度顯著增強(P<0.01)，而給予GLP-1預(yù)處理后，心肌微血管內(nèi)皮細胞熒光強度顯著減弱(P<0.05)，見圖4A。ROS試劑盒檢測進一步證實，高糖作用下心肌微血管內(nèi)皮細胞生成ROS增多(P<0.01)，而給予GLP-1預(yù)處理后心肌微血管內(nèi)皮細胞生成ROS顯著降低(P<0.05)，見圖4B。

Figure 4.Effects of GLP-1 on high glucose (HG)-induced oxidative stress in cardiac microvascular endothelial cells. A: the results of DHE staining (red, DHE; blue, DAPI; the scale bar=25 μm); B: ROS production detected by superoxide assay kit.Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs HG+vehicle group.

6 GLP-1對高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞Keap1、Nrf2和HO-1表達的影響

心肌微血管內(nèi)皮細胞在高糖作用下，keap1蛋白表達顯著升高(P<0.01)，核蛋白Nrf2表達顯著減低(P<0.01)，抗氧化應(yīng)激相關(guān)分子HO-1顯著降低(P<0.01)；而給予GLP-1預(yù)處理的心肌微血管內(nèi)皮細胞，與單純高糖組相比，Keap1表達降低(P<0.05)，Nrf2和HO-1表達顯著升高(P<0.05)，見圖5。

7 GLP-1通過Keap1-Nrf2信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞ROS生成

高糖作用下心肌微血管內(nèi)皮細胞ROS生成增多(P<0.01)，給予GLP-1預(yù)處理后ROS 生成降低(P<0.05)，而預(yù)先予以si-Nrf2處理可抵消GLP-1對高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞ROS生成的抑制作用(P<0.05)，給予NC-siRNA處理ROS生成無顯著性變化(P>0.05)，見圖6。

Figure 6.GLP-1 inhibited HG-induced ROS production in car-diac microvascular endothelial cells through Keap1-Nrf2 pathway.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs HG+vehicle group; &P<0.05 vs HG+GLP-1 group.

討 論

心肌微血管內(nèi)皮細胞在心肌中數(shù)量最多，糖尿病心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷早于大血管及心肌細胞，可進一步引起心臟微循環(huán)灌注不良、心肌能量代謝異常及心肌間質(zhì)纖維化[8]。目前認為引發(fā)糖尿病心肌微血管損傷的可能機制包括氧化應(yīng)激反應(yīng)增強、蛋白激酶C活化、晚期糖基化終產(chǎn)物生成增加和多元醇通路激活等。但是，糖尿病心肌微血管病變的具體機制仍未完全闡明，目前仍無有效的控制心肌微血管病變的措施。

有科學(xué)家提出“氧化應(yīng)激反應(yīng)增強是糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制”[9-10]。在高脂喂養(yǎng)的糖尿病ApoE-/-小鼠，阿托伐他汀可通過類視黃醇X受體α(retinoid X recptor α, RXRα)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進一步抑制動脈粥樣斑塊形成[11]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，予以運動(跑臺)干預(yù)后，心肌組織NADPH氧化酶亞基p47phox和gp91phox表達降低[12]，以上研究提示，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對于保護糖尿病心血管并發(fā)癥具有潛在意義。目前實驗研究常用的抗氧化劑有維生素C、維生素E、α-硫辛酸、超氧化物歧化酶、褪黑素等，但是其研究結(jié)果并不令人十分滿意。

GLP-1是具有多器官保護作用的胃腸道內(nèi)分泌激素，近年研究提示其對內(nèi)皮細胞、心肌細胞等也有保護功能[13]。GLP-1在體內(nèi)可迅速被二肽基肽酶4降解而失去活性，因此在體一般給予GLP-1激動劑或二肽基肽酶4抑制劑。缺血前或再灌注同時給予離體或在體大鼠心臟輸注GLP-1，可降低心肌梗死面積，但是予以GLP-1受體拮抗劑(9-39)干預(yù)后其保護作用消失[14]。給予糖尿病大鼠皮下注射利拉魯肽(二肽基肽酶4抑制劑)，研究顯示利拉魯肽并沒有影響血漿血糖、胰島素水平以及體重，但是在利拉魯肽治療的糖尿病大鼠心肌組織PKC表達水平降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)下降，心肌脂肪變性改善，其作用機制可能是通過AMPK-Sirt1信號通路介導(dǎo)的[15]。但是，GLP-1對糖尿病心肌微血管保護作用的研究仍較少，其發(fā)揮保護作用的機制尚未完全闡明，有待于更加深入的探討。本研究中，我們采用的是STZ腹腔注射誘導(dǎo)1型糖尿病模型，該模型排除了肥胖和胰島素抵抗等因素的干擾，有助于明確GLP-1對高糖誘導(dǎo)的心肌微血管的保護作用。研究結(jié)果提示GLP-1激動劑艾賽那肽可改善糖尿病大鼠心肌微血管屏障功能。此外，小劑量的艾賽那肽并未顯著降低糖尿病大鼠的血糖，從一定程度上排除了GLP-1的降糖作用所致的心血管保護作用。進一步的體外實驗觀察到GLP-1干預(yù)可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并改善單層心肌微血管內(nèi)皮細胞屏障功能，提示GLP-1發(fā)揮保護作用的機制可能是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)實現(xiàn)的。

Keap1-Nrf2信號通路是機體重要的抗氧化信號通路，Keap1-Nrf2信號通路失活可導(dǎo)致活性氧自由基在體內(nèi)的積累[16]。糖尿病狀態(tài)下激活 Keap1-Nrf2信號通路可顯著減少ROS生成，并改善由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)出現(xiàn)的組織細胞功能紊亂。Sitagliptin可調(diào)節(jié)糖尿病腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機制可能是通過下調(diào)miR-200a，進一步激活Keap1-Nrf2信號通路實現(xiàn)的[17]。引起糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個主要原因也是氧化應(yīng)激損傷，通過激活Nrf2通路，可以抑制氧化應(yīng)激，延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展[18]。硫化氫可緩解STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠動脈粥樣硬化進程，機制可能是激活Keap1-Nrf2信號通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。Keap1-Nrf2信號通路可能是防治糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的一個有前景的潛在靶點，但是在糖尿病心肌微血管損傷領(lǐng)域目前仍缺少相關(guān)研究。在本研究中，高糖作用下心肌微血管內(nèi)皮細胞Keap1蛋白表達升高，Nrf2和HO-1蛋白表達降低，而給予GLP-1干預(yù)后，Nrf2和HO-1蛋白表達升高，Keap1蛋白表達減低，提示Keap1-Nrf2信號通路可能參與GLP-1對高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞的保護作用；進一步采用si-Nrf2轉(zhuǎn)染心肌微血管內(nèi)皮細胞，si-Nrf2處理可抵消GLP-1對高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細胞的保護作用。

綜上所述，GLP-1可抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善心肌微血管屏障功能，這些保護效應(yīng)可能是通過Keap1-Nrf2信號通路介導(dǎo)實現(xiàn)的。