高靜雯 曾宗波 武磊 張莉 齊亞銀

摘要：為查明導致新疆某規(guī)?；H場奶驢乳房炎的主要致病菌及其發(fā)病原因，首先進行了現(xiàn)場流行病學調(diào)查，后對20頭奶驢（13頭患乳房炎、7頭健康）的血常規(guī)進行檢測，并無菌采集13頭臨床型奶驢乳房炎的奶樣，采用常規(guī)微生物學方法進行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗。研究結果表明，本次乳房炎的發(fā)生與奶驢營養(yǎng)不良和養(yǎng)殖環(huán)境差息息相關，其中乳房炎組與健康組相比，血紅蛋白、紅細胞、淋巴細胞、粒細胞比例等均有所下降，其余指標變化不明顯。同時，從乳汁中共分離鑒定到16株細菌，其中大腸桿菌13株，鏈球菌3株;藥敏試驗結果表明，大腸桿菌對鏈霉素、恩諾沙星、氟苯尼考的敏感率都在75%以上，對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率在60%以上;鏈球菌對青霉素、氨芐西林、氟苯尼考的敏感率都在60%以上，但對恩諾沙星耐藥率達到100%。研究結果揭示，盡管關于奶驢乳房炎發(fā)病率的報道較少，但通過本次試驗發(fā)現(xiàn)，在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中各種細菌對奶驢乳房炎的威脅不容小覷，且本次分離到的病原菌已經(jīng)表現(xiàn)出比較嚴重的耐藥性。

關鍵詞：驢;乳房炎;生化鑒定;藥敏試驗;血細胞分析

中圖分類號： S858.22?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0196-04

乳房炎是奶牛和奶山羊的常見高發(fā)病，產(chǎn)奶驢也有發(fā)生，以乳房發(fā)熱、腫脹、疼痛、乳汁不通為主[1]。驢乳房炎，主要是由于驢乳腺受微生物、物理、化學和環(huán)境等因素刺激從而產(chǎn)生的一類炎癥反應。驢和其他馬屬動物一樣，哺乳期能產(chǎn)奶，奶驢泌乳期一般可達到7～8個月，驢的產(chǎn)乳量：驢產(chǎn)奶因品種不同標準不一，產(chǎn)后1.5～4個月處于高產(chǎn)期，日單產(chǎn)最高可達3.5～4.0 kg，平均1.5～1.8 kg[2]。驢奶具有較高的開發(fā)利用價值，Malacarne等發(fā)現(xiàn)驢奶具有極高的營養(yǎng)價值，其主要成分與人奶非常相近，可作為人乳的替代品，同時還具有較高的藥用價值，《本草綱目》中記載：“驢乳，氣味甘，冷利，無毒，熱頻飲之可治氣郁，解小兒熱毒，不生痘疹”[3]。因此，驢乳房炎不僅對養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失，更對動物性食品安全與畜牧行業(yè)的發(fā)展造成了巨大的安全隱患。

2018年6月，新疆某規(guī)?；H場在采集驢奶時發(fā)現(xiàn)驢奶出現(xiàn)異常，其中有13頭驢出現(xiàn)典型乳房炎癥狀，奶汁呈絮狀，黃褐色泛黑。驢乳房炎給驢場帶來了奶產(chǎn)量和奶質量降低、驢奶的廢棄，甚至患驢的淘汰等較大的經(jīng)濟損失。本研究對該規(guī)?；H場中病驢進行驢乳房炎致病菌的分離鑒定，并對這13頭采樣驢和7頭健康驢進行血細胞成分分析測定，旨在明確引起驢乳房炎的主要病原菌種類，并探討乳房炎患驢和健康驢血細胞成分的關系。

1?試驗材料

1.1?病料來源

采集新疆某規(guī)模化驢場明顯發(fā)作驢乳房炎的13頭驢的奶樣。采集時，先對乳頭進行消毒，棄掉前5～10 mL驢乳后無菌采集乳樣5 mL左右。

1.2?主要試劑和儀器

培養(yǎng)基：LB肉湯、LB瓊脂、伊紅-美蘭瓊脂（EMB）;麥康凱培養(yǎng)基（MAC）均購自北京奧博星生物科技有限責任公司;腦心浸出液肉湯（BHI）（青島高科園海博生物技術有限公司）;羊血瓊脂;鏈球菌選擇培養(yǎng)基。

鑒定用培養(yǎng)基及試劑：硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側金盞花醇、木膠糖、七葉苷（青島高科技生物園海博生物有限公司）。

藥敏紙片：包括β-內(nèi)酰胺類3種：青霉素（10 μg，P）、氨芐西林（10 μg，AMP）、阿莫西林（10 μg，AMC）;氨基糖苷類2種：慶大霉素（10 μg，GEN）、鏈霉素（10 μg，STR）;喹諾酮類1種：恩諾沙星（15 μg，ENR）;酰胺醇類1種：氟苯尼考（30 μg，F(xiàn)FC）;大環(huán)內(nèi)酯類1種：紅霉素（10 μg，E）;均購自杭州微生物試劑有限公司。

儀器：顯微鏡（型號CX21FS1），血細胞分析儀（XFA6100A型），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），凈化工作臺（上海鴻都電子科技有限公司）。

2?試驗方法

2.1?現(xiàn)場流行病學調(diào)查及血常規(guī)分析

2.1.1?現(xiàn)場流行病學調(diào)查

采用現(xiàn)場流行病學調(diào)查的手段和方法，查找導致該次奶驢乳房炎暴發(fā)的主要因素，包括天氣、環(huán)境、飼養(yǎng)、擠奶情況以及發(fā)病率、死亡率等。

2.1.2?血常規(guī)檢測

從該標準化驢場通過頸靜脈采血的方法[4]，采集13頭發(fā)病驢的血液和7頭健康母驢的血液進行血細胞成分的檢測。

判定標準：參考《獸醫(yī)檢驗》[5]和姜生成等的研究中驢的血細胞成分標準[6]進行分析（表1）。

2.2?細菌分離、培養(yǎng)及純化

首先加入適量采集的奶樣到普通LB肉湯進行 12 h 搖床培養(yǎng)，然后分別接種到不同的固體培養(yǎng)基上，包括LB平板、麥康凱培養(yǎng)基及血平板上，置于37 ℃溫箱培養(yǎng) 24 h，觀察菌落及菌體的形態(tài)學特征;然后挑取單個菌落進行純化，保存菌株，待進一步進行鑒定。

2.3?細菌的生化鑒定

將純化后的單個菌落分別接種于硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側金盞花醇、木膠糖、七葉苷等鑒定培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6～48 h，觀察試驗結果（表2）。

2.4?藥敏試驗

藥物敏感性試驗按照CLSI推薦的K-B（Kirby-Bauer）法進行[7]，將純化的菌株分別在LB肉湯培養(yǎng)18～24 h，用移液槍吸取500 μL菌液置于普通LB瓊脂平板上，用涂布器進行涂勻，反復、多次涂抹，待菌液快干燥時，在平板上均勻貼上5片不同的藥敏紙片，置于溫箱培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌環(huán)的直徑，根據(jù)抑菌圈的大小判斷其對抗菌藥的敏感性。判定標準見表3。

3?試驗結果

3.1?現(xiàn)場流行病學調(diào)查結果

養(yǎng)殖規(guī)模：擠奶驢872頭，公驢23頭。

發(fā)病時間：2018年6月份。

擠奶設備：移動式手工輔助擠奶設備，主要依靠人工擠奶，擠奶時未做消毒處理。

發(fā)病率與死亡率：13頭驢出現(xiàn)典型乳房炎癥狀，奶汁呈絮狀，黃褐色或者黑色;無奶驢死亡。

飼養(yǎng)方式及營養(yǎng)比例：半舍飼化飼養(yǎng)，主要飼喂玉米秸稈、玉米及少量苜蓿，均采用自由采食方式。

3.2?血常規(guī)檢測結果

檢測發(fā)病驢和健康驢的血液，由表4可知，健康驢的血細胞的數(shù)據(jù)都是在驢血細胞標注的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)有小幅度波動;發(fā)病驢的血細胞大部分數(shù)量相比下降了，紅細胞、血紅蛋白、粒細胞比率及淋巴細胞比率均有所下降。

3.3?細菌分離純化及形態(tài)學結果

將13份奶樣進行接種培養(yǎng)，分離出16株可疑菌株，通過麥康凱培養(yǎng)基、伊紅-美藍培養(yǎng)基、以及鏈球菌選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)，觀察其菌落及菌體的形態(tài)，其中13株菌疑似大腸桿菌（圖1），3株疑似鏈球菌（圖2）。所有株菌在普通LB培養(yǎng)基上都長出邊緣光滑且規(guī)則的菌落，其中13株菌落較大1.0～2.5 mm，3株菌落較小直徑為1.0～1.5 mm;13株菌在麥康凱培養(yǎng)基上長出粉紅色圓滑的菌落（圖3），在伊紅-美藍培養(yǎng)基上長出具有金屬光澤的菌落（圖4），革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性、粉紅色、兩端鈍圓的短桿狀菌[8];剩余3株菌在鏈球菌選擇培養(yǎng)基上長出了圓形、隆起、光滑、濕潤、露滴狀菌落（圖5），同時在血平板上長出了光滑、伽馬-溶血狀、半透明邊緣的菌落[9]（圖6）。

3.4?生理生化鑒定結果

對分離純化的細菌進行生理生化特性鑒定，進一步探究細菌的特性?觀察鑒定試劑的顏色變化情況以及是否有產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況等，結果見表5。

由表5可知，疑似為大腸桿菌的13株菌生化鑒定結果基本一致，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，蛋白胨水和葡磷胨水都變成紅色陽性，賴氨酸脫羧酶試驗陽性，能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、側金盞花醇和木膠糖，其生化特性符合大腸桿菌的特性[10];另外3株菌的生化鑒定顯示其能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、木膠糖，并且不能使七葉苷水解，其特性基本符合鏈球菌的特征。

3.5?藥敏試驗結果

由表6可知，2類菌同時對鏈霉素和氟苯尼考都是高敏的;大腸桿菌對氟苯尼考最敏感，敏感率92%;對恩諾沙星和鏈霉素敏感率分別84.6%和76.9%;對β-內(nèi)酰胺類藥物較為耐藥，氨芐西林和阿莫西林耐藥率均是61.5%，青霉素更是100%耐藥。鏈球菌則是對氨芐西林、阿莫西林和氟苯尼考有100%的高度敏感率;對青霉素和鏈霉素也較為敏感，敏感率為66.7%;對恩諾沙星則完全耐藥。

4?分析與討論

導致各種動物乳房炎的最直接原因主要是病原微生物的感染[11]，例如葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、沙門氏菌、腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、酵母菌、支原體等[12]。其中大腸桿菌性乳房炎常引起急性炎癥，使乳房炎從隱性乳房炎轉變?yōu)榕R床型[13]，鏈球菌性乳房炎往往是由于飼養(yǎng)環(huán)境造成的。試驗結果表明，發(fā)病驢血紅蛋白和紅細胞數(shù)量相對減少，淋巴細胞不具有吞噬作用，其比例下降說明自身免疫力下降;粒細胞比率下降，白細胞數(shù)量明顯增多，說明由于有炎癥反應，導致其產(chǎn)生抗體來抵抗病原菌，這與張銀亮關于乳房炎的發(fā)生與免疫力之間相關性的內(nèi)容相符[14]。同時該驢場的飼養(yǎng)管理差、環(huán)境不良、營養(yǎng)水平低也是導致發(fā)生乳房炎的誘因，而且對發(fā)病驢群也沒有采取隔離措施，擠奶設備也沒有分開使用。

近年，乳房炎在奶牛上為高發(fā)病，因此研究得也較為透徹，而驢的乳房炎鮮有報道。根據(jù)藥敏試驗及血常規(guī)分析，分離株已經(jīng)表現(xiàn)明顯的耐藥性，建議該場采用中藥和高敏抗炎藥物相結合的方式進行該病的綜合防控[1]，尤其要有“防大于治”的思維，定期對驢奶進行乳液中體細胞數(shù)量檢測或CMT（加州乳房炎檢測法）進行檢測，避免隱性乳房炎轉變?yōu)榕R床型乳房炎[15]。

本研究通過現(xiàn)場流行病學調(diào)查、血常規(guī)檢測和細菌的分離鑒定及藥敏相結合的方式，查明了導致新疆某規(guī)?；H場奶驢乳房炎的發(fā)病原因，為控制該場奶驢乳房炎的蔓延提供了科學依據(jù)，同時為進一步研究驢乳房炎提供了科學支撐。

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