解 影， 馬 勇， 謝春艷 ， 王海華， 臺文靜， 方 俊

（1.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院湖南省豬場廢棄物無害化處理與資源化利用工程研究中心，湖南長沙410128； 2.青島海大生物集團有限公司，山東青島266111）

滸苔 （Entermopha） 是中國東海岸常見的藻類，富含蛋白質、粗纖維和維生素等營養(yǎng)物質，具有豐富的食用和藥用價值（Cui 等，2018）。 但近年來， 海洋生態(tài)惡化導致滸苔頻繁爆發(fā) （Xu 等，2015），造成養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)的巨大損失。因此，開發(fā)、利用滸苔或其提取物，使之變廢為寶，對海洋生態(tài)平衡具有重要意義。 滸苔多糖（EP）是從滸苔中提取出的一種可溶性硫酸化雜多糖，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化及提高免疫（Wei，2014）等多種生物功能。研究表明，添加滸苔多糖可以促進小鼠腸道中雙歧桿菌和乳酸菌的生長， 維持腸道菌群平衡，促進腸道健康（Shang 等，2018）。

腸道既是動物消化和吸收營養(yǎng)物質的主要場所，也是最大的免疫器官，在機體生長發(fā)育過程中至關重要（Wijtten 等，2011）。 產腸毒素大腸桿菌（ETEC）感染會導致腸道屏障損傷，造成畜牧業(yè)嚴重的經濟損失（Hiqashi 等，2000），ETEC K88 感染可導致機體腸道損傷， 引起腹瀉等癥狀（Gemma等，2014）。本試驗以ETEC K88 感染小鼠為模型，研究滸苔多糖對小鼠腸道形態(tài)結構、 腸道屏障及血清細胞因子水平的影響， 探討滸苔多糖對腸道屏障的保護作用及機制， 為其作為飼料添加劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 EP 購自青島海大生物集團有限公司；ETEC K88 來自中國科學院亞熱帶生態(tài)研究所；Mouse IL-6 ELISA Kit（DKW12-2060-006）購自北京達科為生物技術有限公司；MouseTNF-α ELISA Kit （KE10002）購自美國Proteintech 公司；抗體β-actin （sc-47778） 購自Santa 公司；ZO-1（21773-1-AP） 購自Proteintech 公司；Claudin-1（ab129119）購自Abcam 公司；Occludin（66378-1-Ig）購自Proteintech 公司； NF-κB（6956）、Phospho-NF-κB（3033）購自Cell Signaling Technology公司；PIPA 蛋白裂解液、 磷酸酶抑制劑混合物C（50×）、PMSF （100 mM）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、5×Loading buffer 購自碧云天生物技術公司。

1.2 試驗設計 選用30 只20 g 左右清潔級ICR雌性小鼠（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，自然光照，自由采食和飲水。 小鼠隨機分為5 組，每組6 只。 即：對照組、ETEC 模 型 組、300 mg/L EP+ETEC 組、600 mg/L EP+ETEC 組、1000 mg/L EP+ETEC 組。 對照組飼喂飲用水和普通日糧，EP 試驗組在飲用水中添加相應劑量的滸苔多糖。小鼠每天自由飲食，空白對照組小鼠于試驗第8 天連續(xù)灌胃無菌生理鹽水3 d，其余四組灌胃等體積ETEC 菌懸液（濃度為5×109cfu/mL）。 每天觀察小鼠的精神狀態(tài)并記錄小鼠體重和采食量，試驗第14 天采樣。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 空腸形態(tài)學分析 將固定于福爾馬林溶液中的空腸樣品，常規(guī)脫水后石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組小鼠的空腸形態(tài)結構。 Shineso （杭州迅數） 顯微圖像分析系統(tǒng)進行拍照， 應用Motic 2.0 通用圖像分析軟件對圖片進行分析處理，分別測量腸道絨毛高度、隱窩深度、并計算絨腺比（絨毛高度與隱窩深度的比值）。

1.3.2 血清中細胞因子的檢測 ELISA 檢測：按照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測血清中IL-6 及TNF-α 的濃度。

1.3.3 空腸組織中的蛋白質制備與檢測 空腸組織樣研磨后加入適量PIPA 蛋白裂解液 （加入100 mM PMSF 和50×的磷酸酶抑制劑）， 冰上充分裂解1 h，離心后BCA 法測定蛋白質濃度，加入Loading buffer 煮沸制樣。 Western Blot 方法檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1 及NFκB 和磷酸化NF-κB（p-NF-κB）的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 進行試驗數據的單因素方差分析（one-way ANOVA，LSD），Duncan 氏法多重比較檢驗，結果以“平均值±標準誤”表示。 P ＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 滸苔多糖對小鼠平均日增重的影響 試驗期間，ETEC 感染后小鼠精神萎靡、食欲下降且毛色暗淡。 感染ETEC 的小鼠在灌胃后的第三天狀態(tài)均有所好轉， 但ETEC 模型組中個別小鼠仍然有行動遲緩等癥狀， 第四天全部小鼠的精神及活動狀態(tài)都恢復正常。 小鼠平均日增重如表1，灌胃前， 所有小鼠平均日增重無顯著性差異 （P ＞0.05），灌胃后，模型組小鼠的平均日增重較對照組顯著降低了65.85%（P ＜0.05）。

表1 滸苔多糖對小鼠平均日增重的影響 g

2.2 滸苔多糖對小鼠血清中細胞因子濃度的影響 由表2 可知，與空白對照組相比，ETEC 模型組IL-6 的濃度顯著增高了73.68%（P ＜0.05）；TNF-α 濃度無顯著性差異 （P ＞0.05）。 與ETEC模型組相比， 添加600 mg/L 滸苔多糖組血清中IL-6 和TNF-α 的濃度顯著降低（P ＜0.05），分別降低了56.69%和30.22%。

表2 滸苔多糖對小鼠血清中細胞因子濃度的影響pg/mL

2.3 滸苔多糖對小鼠空腸形態(tài)結構的影響 由表3 可知， 對小鼠空腸形態(tài)學進行觀察和統(tǒng)計學分析，ETEC 模型組的空腸絨毛頂端上皮細胞脫落嚴重，隱窩變淺。 相比ETEC 模型組，添加600 mg/L 滸苔多糖組絨毛高度、隱窩深度和絨腺比分別提高13.78%、46.55%和55.5%（P ＜0.05）。 與空白對照組相比， 添加600 mg/L 滸苔多糖對腸道絨毛高度和隱窩深度影響不顯著 （P ＞0.05），但絨腺比顯著提高了45.68% （P ＜0.05）。而添加1000 mg/L 滸苔多糖對腸道黏膜形態(tài)無顯著作用。 說明添加600 mg/L 滸苔多糖不僅可以緩解ETEC 感染導致的腸道損傷， 且有助于促進腸道形態(tài)的發(fā)育。

表3 滸苔多糖對小鼠空腸形態(tài)結構的影響

2.4 滸苔多糖對空腸NF-κB 及緊密連接蛋白表達的影響 由表4 可知， 與空白對照組和ETEC模型組相比， 添加300 mg/L 滸苔多糖組NF-κB表達分別顯著上調了88.89%和82.14%，p-NFκB 表達均上調73.33%（P ＜0.05），添加600 mg/L滸苔多糖組NF-κB 表達分別顯著上調了140.74%和132.14%，p-NF-κB 表達均上調80%（P ＜0.05）， 添加1000 mg/L 滸苔多糖使NF-κB表達顯著上升（P ＜0.05），但對磷酸化NF-κB 無顯著影響（P ＞0.05）。小鼠空腸中的緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 及Claudin-1 的表達結果表明，相比ETEC 模型組，添加300 mg/L 滸苔多糖組小鼠空腸中的Occludin 表達顯著上調28.09%（P ＜0.05），添加600 mg/L 滸苔多糖組Claudin-1 表達顯著上調80%（P ＜0.05），而添加1000 mg/L 滸苔多糖組小鼠空腸組織中的ZO-1 表達顯著上升28.85%（P ＜0.05）。

表4 滸苔多糖對空腸NF-κB及緊密連接蛋白表達的影響

3 討論

腸道絨毛高度和隱窩深度的變化是引起屏障功能和吸收機能改變的主要原因之一（江昌盛等，2017）。 本研究中，ETEC K88 感染降低了小鼠空腸腸道絨毛高度和隱窩深度。 有研究表明，在飼糧中添加昆布多糖， 可提高K88 感染后仔豬小腸絨毛高度和絨腺比（吳濤，2017）。這與本研究中，添加滸苔多糖使小鼠空腸的絨毛高度、隱窩深度和絨腺比均得到相應提高的結果相同。說明滸苔多糖具有改善空腸絨毛形態(tài)，促進小腸消化吸收的功能。

緊密連接蛋白的表達與腸道屏障功能密切相關，其中ZOs、Occludin 和Claudins 被認為是通過結合肌動蛋白細胞骨架參與緊密連接結構完整性的主要整合膜蛋白（Turner，2009）。本研究中，K88攻毒后小鼠空腸Claudin-1 蛋白表達降低， 表明K88 導致腸黏膜損傷。 此結果與ETEC K88 在感染IPEC-1 單層細胞過程中， 下調緊密連接蛋白表達的結果一致（Wang，2017）。 綜合以上研究結果， 說明滸苔多糖可調控腸道緊密連接蛋白的表達，改善腸道屏障的完整性。

IL-6 和TNF-α 是間接評價腸黏膜損傷和通透性受損的常見指標（Al-Sadi 等，2013）。 滸苔多糖粗提物可促進巨噬細胞RAW264.7 的增殖及TNF-α 和IL-6 的分泌，增強免疫調節(jié)功能（陳潔等，2015）。此外，海藻多糖中的硫酸多糖具有抑制TNF-α 表達、 緩解TNBS 誘導的大鼠腸道損傷的作用（Brito 等，2016）。 本研究中，添加滸苔多糖可顯著降低血清中的TNF-α 和IL-6 水平， 說明其具有提高小鼠機體免疫功能的作用。

核轉錄因子（NF-κB）是細胞中維持機體正常生理功能的重要轉錄調節(jié)因子， 在病原及外界刺激下活化，進而調控多種基因的表達，產生細胞因子并參與炎癥反應（Zhang 等，2018）。 已有研究表明， 激活NF-κB 信號通路可促使巨噬細胞產生IL-6，如ETEC 刺激上調IL-6 基因表達，并通過TLR4 觸發(fā)NF-κB 通路產生炎癥反應（Shimazu等，2012）。 也有研究表明，抑制NF-κB 的活化可降低小鼠血清中IL-6 的含量，激活NF-κB 可促進TNF-α 基因的轉錄（賈麗超等，2014）。 此外，植物多糖可通過調節(jié)NF-κB 信號通路， 緩解ETEC K88 感染導致的腸道炎癥和黏膜損傷，從而達到改善腸道屏障功能的作用（Han 等，2016）。本研究中， 添加滸苔多糖使感染ETEC 的小鼠細胞因子分泌降低，但未使NF-κB 表達下調。 原因可能是：（1）ETEC 感染使TNF-α 在機體內激增，觸動負反饋調節(jié)， 導致NF-κB 信號通路被阻斷，抑制NF-κB 表達（王曉晨等，2014）；（2）植物多糖可以促進巨噬細胞大量分泌細胞因子， 從而加快機體的免疫調節(jié)進程（高侃，2015）；（3）添加滸苔多糖使機體更早進入炎癥消退期初期， 血清中細胞因子含量降低，但腸道中NF-κB 表達趨勢尚未改變。綜合本研究結果表明，滸苔多糖可調節(jié)腸道緊密連接蛋白的表達及炎性因子的分泌， 達到保護腸道屏障的作用， 且作用機制與滸苔多糖對NF-κB 信號通路的影響相關，但其具體作用機制還有待進一步研究。

4 結論

飲水中添加滸苔多糖可以改善ETEC K88 感染后小鼠空腸絨毛形態(tài)，上調緊密連接蛋白表達，改善腸道黏膜屏障的完整性， 從而保護動物腸道健康，且在飲用水中添加600 mg/L 劑量的條件下保護效果較為顯著。