王 蓉，朱 杰，金 濤*，劉章勇

（1 長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434025；2 湖北省襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北襄陽(yáng) 441057）

土壤是生物圈內(nèi)發(fā)生氮素循環(huán)的主要場(chǎng)所，而土壤微生物是推動(dòng)氮循環(huán)過(guò)程的主要成員。其中，由微生物所驅(qū)動(dòng)的過(guò)程主要包括了固氮作用、氨化作用、硝化作用和反硝化作用四個(gè)過(guò)程[1-2]。氨氧化作用作為硝化作用的限速步驟，影響著整個(gè)硝化作用的進(jìn)程[3]。因此，大批學(xué)者開展了對(duì)氨氧化細(xì)菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)與古菌 (ammonia oxidizing archaea，AOA) 的研究工作。稻蝦共作是一種利用稻田淺水環(huán)境，通過(guò)在稻田四周開挖環(huán)形溝、加高加固田埂、輔以防逃設(shè)施，既種稻又養(yǎng)蝦的高效生態(tài)種養(yǎng)模式。其共生原理是以廢養(yǎng)缺、互利共生、化害為利。稻蝦共作的優(yōu)點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面[4-6]:一是種養(yǎng)結(jié)合、共生互利，小龍蝦可食除一些蟲草，其糞便能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)，有利于水稻生產(chǎn)；二是循環(huán)安全，稻蝦共作減少了化肥、農(nóng)藥的使用量，有效改善了農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，提高了稻米和小龍蝦的品質(zhì)；三是節(jié)約土地、提高收益，稻蝦共作可以充分利用低湖冷浸田，提高土地利用率，降低生產(chǎn)成本。當(dāng)前，我國(guó)農(nóng)業(yè)正面臨資源與環(huán)境約束和農(nóng)民增收難度加大的難題，稻蝦生態(tài)種養(yǎng)高效模式的興起，被農(nóng)業(yè)部譽(yù)為“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一次革命”，在長(zhǎng)江中下游地區(qū)得到了大面積的推廣。

由于稻蝦田常年浸泡，長(zhǎng)期處于厭氧或干濕交替的狀態(tài)，硝化-反硝化作用強(qiáng)烈，顯著影響由微生物驅(qū)動(dòng)的土壤氮循環(huán)過(guò)程，因此稻蝦共作模式下土壤微生物的數(shù)量、群落多樣性及結(jié)構(gòu)對(duì)于發(fā)展稻蝦共作高效生態(tài)友好型農(nóng)業(yè)具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為氨氧化作用的主要參與者是氨氧化細(xì)菌，后有研究發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌也參與了氨氧化作用，并且具有與氨氧化細(xì)菌相同的氨單加氧酶參與編碼的基因amoA，這些研究發(fā)現(xiàn)為研究參與土壤氮素的硝化過(guò)程微生物提供了新的思路。隨著熒光定量PCR、DGGE、高通量測(cè)序等分子技術(shù)在我國(guó)的快速發(fā)展，針對(duì)氨氧化微生物的研究主要集中在不同類型農(nóng)田土壤，如酸性紅壤、堿性潮土、旱地土壤以及土壤含水量、不同施肥模式與pH 等因素下氨氧化細(xì)菌與古菌的群落豐度、多樣性及群落組成進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[7-8]。其中有研究表明農(nóng)田環(huán)境中AOA 的數(shù)量遠(yuǎn)高于AOB 的數(shù)量[9]；He 等[10]通過(guò)對(duì)酸性紅壤的研究發(fā)現(xiàn)，AOA 和AOB 在稻田土壤的豐度均與土壤硝化潛勢(shì) (PNR) 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，且在紅壤中AOA 的豐度遠(yuǎn)高于AOB，此外，土壤pH 對(duì)AOA 的結(jié)構(gòu)組成的影響強(qiáng)度高于AOB；有研究發(fā)現(xiàn)高氮量化肥的投入可顯著增加AOB 的數(shù)量并改變AOB 的群落組成，但對(duì)AOA 無(wú)顯著影響[11]；楊亞?wèn)|等[12]研究發(fā)現(xiàn)華北平原地區(qū)堿性小麥土壤表層AOB 比AOA 對(duì)氮肥的響應(yīng)更靈敏，且施氮可以顯著改變AOB 的數(shù)量及結(jié)構(gòu)，但對(duì)AOA 無(wú)顯著影響；劉若瑄等[13]研究證明相比氨氧化古菌，氨氧化細(xì)菌對(duì)土壤水分的響應(yīng)更加顯著。

由于稻蝦田土壤長(zhǎng)期處于淹水的狀態(tài)，僅在水稻曬田期出現(xiàn)短期土壤落干情況，導(dǎo)致稻蝦田長(zhǎng)期浸泡水下形成了特殊的區(qū)域小環(huán)境，氧化還原過(guò)程強(qiáng)烈并顯著影響著由微生物驅(qū)動(dòng)的地球生物化學(xué)循環(huán)。有研究表明[6]，稻蝦輪作的常年泡水特點(diǎn)加劇了土壤潛育化過(guò)程且隨著年限的增長(zhǎng)，土壤易氧化態(tài)有機(jī)碳含量高于常規(guī)稻田模式。蔡晨等[14]對(duì)江漢平原稻蝦輪作模式下水稻土的土壤理化性質(zhì)研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期稻蝦輪作可增加土壤pH、氮磷鉀等養(yǎng)分。前人對(duì)稻蝦田間雜草多樣性調(diào)查的結(jié)果顯示，稻蝦輪作模式下由于龍蝦的活動(dòng)導(dǎo)致稻田雜草發(fā)生率下降且降低了雜草的多樣性及豐富度[15]。佀國(guó)涵等[16]研究結(jié)果顯示稻蝦輪作模式增加了土壤微生物活性及群落多樣性。綜上所述，稻蝦共作模式對(duì)土壤環(huán)境影響較大，且有研究證實(shí)土壤氨氧化微生物對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)較大。迄今為止，關(guān)于稻蝦共作模式的研究主要集中在該模式的生態(tài)種養(yǎng)技術(shù)、經(jīng)濟(jì)效益以及對(duì)稻田土壤理化性質(zhì)的影響等方面[16-17]，卻鮮有關(guān)于稻蝦土壤氨氧化微生物方面的研究報(bào)道。因此，開展稻蝦共作模式下土壤氨氧化微生物群落演變規(guī)律的研究對(duì)于稻蝦共作模式的推廣具有重要意義。本研究通過(guò)設(shè)置常規(guī)中稻模式與稻蝦共作種養(yǎng)模式，在研究土壤基本理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，借助熒光定量PCR 和Illumina Miseq 高通量測(cè)序平臺(tái)等分子生物學(xué)技術(shù)研究土壤氨氧化微生物的基因豐度及群落結(jié)構(gòu)，旨在揭示稻蝦共作模式下土壤氨氧化作用的原理，為稻蝦共作模式的生態(tài)研究和推廣提供理論和實(shí)際指導(dǎo)，為稻蝦共作田間管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)位于江漢平原腹地的湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地，該地水源充沛，溫光資源充足，屬典型的亞熱帶季風(fēng)性氣候。試驗(yàn)地土壤基本理化性質(zhì)為:pH 7.5、有機(jī)質(zhì)38.8 g/kg、全氮0.75 g/kg、全磷0.54 g/kg、速效鉀17.09 mg/kg。試驗(yàn)于2014—2016 年連續(xù)開展兩年，設(shè)置常規(guī)中稻 (MR)和稻蝦共作 (CR) 兩種模式，并設(shè)置3 次重復(fù)，試驗(yàn)田呈矩形，長(zhǎng)12 m、寬5 m。供試水稻品種為“隆兩優(yōu)華占”，小龍蝦品種為克氏原鰲蝦 (Procambarus clarkii)。所施肥料為尿素 (N 46%)、過(guò)磷酸鈣 (P2O512%)和氯化鉀 (K2O 60%)，年均純養(yǎng)分施用量為N 180 kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O 105 kg/hm2。氮肥按基肥∶蘗肥 為6∶4 施用，磷肥全部基施，鉀肥按基肥∶追肥為5∶5 施用。常規(guī)中稻模式稻作期田間前期灌水、中期短暫曬田、后期覆水。稻蝦共作模式稻作期為每年6 月至9 月，9 月底水稻收獲后覆水泡田養(yǎng)蝦。蝦苗按15 × 104～20 × 104只/hm2的密度于水稻收獲后投放，次年4 月中下旬至6 月上旬捕撈成蝦，捕蝦完成后進(jìn)行下一季水稻種植，如此循環(huán)往復(fù)。兩種模式下的水稻秸稈全量還田，其他田間管理措施完全相同。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集分為兩部分。一部分用土鉆在田間選取5 點(diǎn)采集土樣并混合 (5 點(diǎn)采樣法)，存放備土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定使用。將土樣去除根系、石子等雜物在陰涼處風(fēng)干，磨碎后過(guò)8 mm 鐵篩，用于土壤全氮、全碳、堿解氮及pH 的測(cè)定。另外一部分土壤用于土壤微生物的測(cè)定，土壤微生物樣品于2016 年水稻抽穗期采集。需在采樣時(shí)用谷物采樣器采集0—10 cm 表層土，去除土壤根系、石子及其他雜物，即刻用錫箔紙包裹好土樣，放入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80℃冰箱待測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定參考鮑士旦第三版《土壤農(nóng)化分析》。土壤全氮、全碳使用元素分析儀 (ECS4024，Costech，Italy) 測(cè)定；堿解氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法；土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量采用2 mol/L KCl 溶液浸提，流動(dòng)分析儀(AA3，BRAN + LUEBBE，德國(guó)) 測(cè)定；pH 采用電位法 (水∶土 = 2.5∶1) 測(cè)定。

1.3.2 土壤DNA 提取與熒光定量PCR 分析 土壤總DNA 利用DNA 試劑盒 (PowerSoil? DNA Isolation Kit，Mobio，USA) 進(jìn)行提取。取經(jīng)-80℃低溫保存的土壤鮮樣0.25 g，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA，提取的DNA 的濃度與純度用NanoDrop ND-1000UVevis 分光光度計(jì) (ThermoScientific，Rockwood，TN，USA) 檢測(cè)。參照電泳檢測(cè)結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物采用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，在ABI7500 熒光定量PCR 儀 (ABI，CA，USA)上進(jìn)行定量檢測(cè)。選取不同的特異性引物對(duì)AOA amoA、AOB amoA 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所用的引物序列及擴(kuò)增所用的體系如表1 所示。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物的回收和純化 所用的樣品均參照正式實(shí)驗(yàn)的條件進(jìn)行，每個(gè)樣品采用3 次重復(fù)，同一樣本的混合PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物回收采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠，TrisHCL 洗脫，檢測(cè)采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。

1.3.4 Illumina Miseq 高通量測(cè)序 PCR 產(chǎn)物回收后測(cè)定其濃度，之后根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序量的要求，將兩種模式的樣品混勻，使各模式用于測(cè)序的樣品DNA 濃度保持一致，雙末端測(cè)序采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行，本試驗(yàn)的測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技公司完成。

首先根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對(duì)的reads 拼接為一條序列，同時(shí)對(duì)reads 的質(zhì)量和merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，有效序列可依據(jù)序列首位兩端的barcode 和引物序列來(lái)區(qū)分樣品得到，將序列方向進(jìn)行校正，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。

表 1 熒光定量PCR 擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序[11]Table 1 Real-time PCR amplification of primers and reaction procedures

操作分類單元 (operational taxonomic units，OTU) 是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析人為給某一個(gè)分類單元 (品系，屬，種、分組等) 設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個(gè)樣本測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作 (cluster)。通過(guò)歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組即一個(gè)OTU?？筛鶕?jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU 劃分，通常在97%相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。使用軟件Usearch7.1 平臺(tái)，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列 (不含單序列) 進(jìn)行OTU 聚類，在聚類過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列?；贠TU 分類可進(jìn)行α 多樣性分析與β 分析。采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分析，得到對(duì)應(yīng)的每個(gè)OTU 的物種分類信息，并分別在domain (域)、kingdom (界)、phylum(門)、class (綱)、order (目)、family (科)、genus(屬)、species (種) 各個(gè)分類水平下統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS22.0 對(duì)土壤基本理化性質(zhì)、AOA 和AOB amoA 基因拷貝數(shù)以及群落α 多樣性指數(shù) (Shannon、ACE、Chao1、Simpson 以及Sobs)進(jìn)行單因素方差分析與Personal 相關(guān)性分析。使用R 軟件工具制作群落柱形圖、Venn 圖。采用CANOCO 5.0 軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)和AOA，AOB amoA 基因群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析 (redundancy analysis，RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同模式下土壤基本理化性質(zhì)

常規(guī)中稻模式與稻蝦共作模式下的土壤理化性質(zhì)如表2 所示。方差分析結(jié)果表明，稻蝦模式改變了部分土壤理化性質(zhì)。其中，稻蝦共作模式下的土壤全碳、全氮、硝態(tài)氮含量均顯著高于常規(guī)中稻模式，堿解氮含量與銨態(tài)氮含量均高于常規(guī)中稻模式，差異不顯著 (P ＞ 0.05)；稻蝦共作模式下C/N 與pH 低于常規(guī)中稻模式，差異不顯著 (P ＞ 0.05)。研究結(jié)果表明，相比常規(guī)中稻種植模式，稻蝦共作顯著增加了土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮含量，對(duì)堿解氮、C/N 及pH 沒有顯著影響。

2.2 稻蝦共作對(duì)稻田土壤AOA 與AOB 群落α 多樣性指數(shù)的影響

Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)反映了群落的豐富度，指數(shù)值越大表示群落豐富度越高。從表3可知，常規(guī)中稻模式Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)依次為49.79、49.53、47.67，稻蝦共作模式依次為33.26、32.42、32.33，單因素方差分析表明，稻蝦共作模式AOA 群落三個(gè)指數(shù)均顯著低于常規(guī)中稻模式 (表3)。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性，Shannon 指數(shù)值越高，表示群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越高，表示群落多樣性越低。稻蝦共作模式AOA 的Shannon 指數(shù) (1.54)與常規(guī)中稻模式 (1.73) 差異不顯著，但是稻蝦共作模式的Simpson 指數(shù) (0.36) 顯著高于常規(guī)中稻模式(0.26)。表明較常規(guī)中稻模式，稻蝦共作模式顯著降低了稻田土壤AOA 群落豐富度及群落多樣性。

由表3 中AOB 結(jié)果可知，常規(guī)中稻模式的Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Sobs 指數(shù)依次為34.03、33.67、33.00，稻蝦共作模式依次為26.13、26.00、26.00，兩模式AOB 多樣性指數(shù)單因素方差分析差異均不顯著。稻蝦共作模式的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)與常規(guī)中稻模式差異均不顯著，表明稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤AOB 微生物群落豐富度及群落多樣性均沒有顯著影響。

表 2 稻蝦共作和常規(guī)中稻模式稻田土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties in paddy fields under integrated rice-crayfish farming and conventional middle rice systems

表 3 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式土壤氨氧化微生物群落α 多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indices of soil ammonia oxidizers in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

2.3 稻蝦共作對(duì)稻田土壤AOA 和AOB 的amoA基因豐度的影響

AOA 和AOB amoA 基因定量分析結(jié)果顯示，稻蝦共作模式AOA 和AOB 的amoA 基因豐度分別為3.13 × 105和7.01 × 105copies/g 干土，常規(guī)中稻模式的AOA 和AOB 的amoA 基因豐度分別為1.41 ×105和3.87 × 105copies/g 干土，稻蝦共作模式AOA 和AOB 的amoA 基因豐度均顯著高于常規(guī)中稻模式 (P ＜ 0.05) (圖1)，且在兩種模式中，AOB amoA 的基因豐度高于AOA amoA 的基因豐度。

2.4 稻蝦共作對(duì)土壤中AOA 和AOB 的amoA 基因物種組成的影響

對(duì)AOA amoA 基因物種水平進(jìn)行Venn 分析 (圖2)，稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式共有14 個(gè)相同的物種，其中稻蝦共作模式獨(dú)有物種3 個(gè)，稻蝦共作模式增加了稻田土壤中AOA amoA 基因物種種類，增加了AOA 物種種類。AOB amoA 基因物種水平Venn 分析 (圖2) 結(jié)果顯示，稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式共有10 個(gè)相同的物種，其中稻蝦共作模式獨(dú)有物種3 個(gè)，常規(guī)中稻模式獨(dú)有物種4 個(gè)，兩種模式共有不同的物種7 個(gè)，占兩種模式物種總數(shù)的41.18%，占相同物種總數(shù)的70%。稻蝦共作模式改變了稻田土壤中AOB amoA 基因的物種組成，減少了AOB amoA 物種數(shù)目。

圖 1 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式土壤AOA amoA 和AOB amoA 基因豐度Fig. 1 Abundance of AOA amoA and AOB amoA in integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice systme

圖 2 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式土壤AOA amoA 和AOB amoA 基因微生物物種分類學(xué)組成Venn 圖Fig. 2 Venn drawings of AOA amoA and AOB amoA gene species taxonomy of rice-crayfish farming system and conventional middle rice system

2.5 稻蝦共作對(duì)AOA 和AOB 物種屬水平相對(duì)豐度的影響

樣品獲得的AOA amoA 基因微生物物種分類在3 個(gè)域、3 個(gè)界、7 個(gè)門、8 個(gè)綱、8 個(gè)目、8 個(gè)科、8 個(gè)屬和17 個(gè)種。將無(wú)法分類的序列定義為無(wú)法歸類，樣品獲得的AOA amoA 基因OTUs 在分類學(xué)域、界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為94.1%、88.2%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%、76.5%和52.9%。

在屬水平，常規(guī)中稻模式具有5 個(gè)相對(duì)豐度大于0.1%的菌屬 (表4)，按相對(duì)豐度從高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota(56.79%)、unclassified_k_norank_d_Archaea(29.82%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota(11.01%)、norank_p_environmental_samples_k_norank(1.63%)、Nitrososphaera(0.7%)。稻蝦共作模式具有6 個(gè)相對(duì)豐度大于0.1%的屬 (表4)，按相對(duì)豐度從高至低依次是norank_c_environmental_samples_p_Thaumarchaeota(40.96%)、unclassified_k_norank_d_Archaea(30.38%)、norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota(25.93%)、norank_p_environmental_samples_k_norank(2.19%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria(0.24%)、Nitrososphaera(0.29%)。對(duì)AOA 屬水平上相對(duì)豐度大于0.1% 的群落物種進(jìn)行顯著性分析(表5)，結(jié)果顯示norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota在稻蝦共作模式中的相對(duì)豐度顯著高于常規(guī)中稻模式 (P ＜ 0.05)。

樣品獲得的AOB amoA 基因微生物物種分類在1 個(gè)域、1 個(gè)界、2 個(gè)門、4 個(gè)綱、6 個(gè)目、8 個(gè)科、11 個(gè)屬和17 個(gè)種。將無(wú)法分類的序列定義為無(wú)法歸類，樣品獲得的AOB amoA 基因OTUs 在分類學(xué)域、界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為100%、100%、94.1%、88.2%、82.4%、76.5%、70.6%和41.2%。

在屬水平上，常規(guī)中稻模式有8 個(gè)相對(duì)豐度大于0.1%的菌屬 (圖3)，相對(duì)豐度的大小從高到低依次是unclassified_k_norank_d_Bacteria (38.41%)、norank_f_environmental_samples (35.23%)、norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria(21.38%)、unclassified_o_Nitrosomonadales (3.47%)、Nitrosospira (0.37%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae (0.15%)、norank_c_environmental_samples_p_Proteobacteria、Nitrosomonas (0.13%)。稻蝦共作模式中有10 個(gè)相對(duì)豐度大于0.1%的優(yōu)勢(shì)菌屬 (圖3)，相對(duì)豐度的大小從高到低依次為norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria(35.21%)、unclassified_k_norank_d_Bacteria(32.66%)、norank_f_environmental_samples(27.28%)、environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae(2.63%)、Nitrosomonas(1.42%)、unclassified_o_Nitrosomonadales(0.31%)、unclassified_f_Nitrosomonadaceae(0.19%)、unclassified_p_Proteobacteria(0.14%)、unclassified_c_Betaproteobacteria(0.12%)。對(duì)AOB 屬水平上相對(duì)豐度大于 ＞ 0.1%的群落物種進(jìn)行顯著性分析 (表6)，結(jié)果顯示稻蝦共作模式中environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae與norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria的相對(duì)豐度顯著高于常規(guī)中稻模式 (P ＜ 0.05)。

表 4 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式下土壤AOA amoA 基因群落屬水平物種組成 (相對(duì)豐度 ＞ 0.1%)Table 4 Species composition of AOA amoA gene community at gene levels under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (relative abundance ＞ 0.1%)

表 5 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式下土壤AOA 屬水平群落組成 (F 值)Table 5 Community composition of soil AOA genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

圖 3 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式下土壤AOB amoA 基因群落屬水平組成 (相對(duì)豐度 ＞ 0.1%)Fig. 3 Genus distribution of AOB amoA gene community in fields under rice-crayfish farming system (CR) and conventional middle rice system (MR) (relative abundance ＞ 0.1%)

2.6 AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

稻田土壤AOA 微生物菌屬與土壤理化性質(zhì)冗余分析結(jié)果顯示 (圖4a)，對(duì)AOA 微生物群落結(jié)構(gòu)影響最大的是硝態(tài)氮 (R2= 0.8073)，其次是總碳 (R2=0.8038)，影響順序?yàn)橄鯌B(tài)氮 ＞ 總碳 ＞ 銨態(tài)氮 ＞ 堿解氮 ＞ pH。RDA 分析的前兩個(gè)軸共解釋了94.58%的群落變化，第一個(gè)軸解釋了62.20%，第二個(gè)軸解釋了32.38%。沿第一軸觀察，常規(guī)中稻模式與稻蝦共作模式在第一軸的正投影相距很遠(yuǎn)，表明稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤AOA 群落結(jié)構(gòu)影響較大。

對(duì)稻田土壤AOB 微生物菌屬和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行RDA 分析 (圖4b)，結(jié)果表明對(duì)AOB 微生物群落結(jié)構(gòu)影響最大的是硝態(tài)氮 (R2= 0.9057)，其次是總碳(R2= 0.8387)，影響順序?yàn)橄鯌B(tài)氮 ＞ 總碳 ＞ 銨態(tài)氮 ＞堿解氮 ＞ pH。RDA 分析的前兩個(gè)軸共解釋了95.04%的群落變化，第一個(gè)軸解釋了74.62%，第二個(gè)軸解釋了20.42%。沿第一軸觀察，MR2、MR3 與CR1、CR2 在第一軸的正投影相距很遠(yuǎn)，MR1 與CR3 位置較近，表明稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤AOB 的群落結(jié)構(gòu)有一定的改變，但稻蝦共作與常規(guī)稻田的AOB 群落結(jié)構(gòu)仍保持著一定的相似性。

表 6 稻蝦共作模式和常規(guī)中稻模式下土壤AOB 屬水平群落組成顯著性分析 (F 值)Table 6 Significant analysis of community composition of soil AOB genus under integrated rice-crayfish farming system and conventional middle rice system (F-value)

圖 4 AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) between AOA and AOB community structures and soil properties

3 討論

3.1 稻蝦共作對(duì)稻田土壤理化性質(zhì)的影響

有研究表明[14]，長(zhǎng)期稻蝦輪作有助于改善耕層土壤結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)土壤緩沖能力和提高pH 及氮、磷、鉀等速效養(yǎng)分含量。本研究結(jié)果表明，與常規(guī)中稻模式相比，稻蝦共作模式下土壤堿解氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮、全碳含量有所增加，其原因可能是稻蝦共作模式下，投供小龍蝦食用的水草、小龍蝦排泄的糞便在微生物與分解酶的驅(qū)動(dòng)下為土壤提供了豐富的碳源與氮源，另外小龍蝦的打洞行為對(duì)土壤的物理結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

3.2 稻蝦共作對(duì)稻田AOA 與AOB 數(shù)量的影響

AOA 和AOB 是影響土壤氮素循環(huán)的關(guān)鍵微生物，控制著土壤氨氧化反應(yīng)的進(jìn)行，直接影響著土壤肥力及土壤N2O 的排放情況。前人研究表明，在中性及堿性土壤中，施肥尤其是大量氮肥的投入可明顯增加AOB 的數(shù)量[10,18]。楊亞?wèn)|等[7]研究結(jié)果顯示，施氮肥顯著增加了華北平原地區(qū)麥田土壤AOB的數(shù)量，但對(duì)AOA 無(wú)明顯影響。解開治等[19]研究表明，有機(jī)無(wú)機(jī)配肥可提高酸性冷浸田土壤AOB 數(shù)量。大量的研究說(shuō)明土壤肥力情況與AOA、AOB 的數(shù)量之間有著緊密的關(guān)系。賀紀(jì)正等[1,20]在土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵微生物機(jī)制中曾表明土壤pH 是影響氨氧化古菌和細(xì)菌組成分布的主要驅(qū)動(dòng)因子之一。本研究土壤屬于偏堿性土壤，更適宜AOB的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期不同施肥模式下的酸性水稻土中，AOA的基因豐度變化相比AOB 更加明顯，而AOA 在酸性土壤中的活性表現(xiàn)的更加突出[21]。同時(shí)在森林土壤、茶園等酸性土壤中，AOA 的存在更能說(shuō)明其在酸性土壤中，其活性與數(shù)量要高于AOB[22-24]。根據(jù)我國(guó)酸性茶園土壤的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，AOA 與AOB 的比值隨著p H 值的升高呈下降趨勢(shì)，同時(shí)表明AOB 相比AOA 更易被pH 值影響[25]。本研究中，不同種植模式中AOB 的數(shù)量均顯著高于AOA，稻蝦共作模式中AOB 與AOA 的比值為2.24，常規(guī)中稻模式中AOB 與AOA 的比值為2.74，與前人的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了偏堿性的土壤更適合AOB的生長(zhǎng)[26-28]。NH3的氧化是氨氧化微生物生長(zhǎng)的唯一能量來(lái)源，在偏堿性的土壤中，銨能夠解離出的NH3濃度較高，更有利于對(duì)NH3具有相對(duì)較低親和力的AOB 生長(zhǎng)[29]。因此，偏堿性的pH 值條件及其他環(huán)境因子決定了兩種模式的稻田土壤的氨氧化微生物的AOB 的豐度優(yōu)勢(shì)。結(jié)果分析表明稻田AOB的數(shù)量顯著高于AOA，說(shuō)明該地區(qū)稻田土壤中AOB 在氨氧化過(guò)程中起主導(dǎo)作用，且稻蝦共作模式下，土壤AOA 與AOB 的含量均高于常規(guī)中稻模式。李虎等[30]研究表明土壤硝態(tài)氮是影響AOA 和AOB豐度的主要環(huán)境因素之一；邱珊蓮等[31]通過(guò)雞糞堆肥試驗(yàn)研究得出硝態(tài)氮濃度與氨氧化微生物的豐度有著密切的聯(lián)系，因此硝態(tài)氮含量是影響氨氧化細(xì)菌與古菌數(shù)量差異的原因。本研究中，稻蝦共作模式下土壤硝態(tài)氮含量高于常規(guī)中稻模式，因此硝態(tài)氮含量可能是導(dǎo)致稻蝦共作模式與中稻種植模式間AOA 與AOB 數(shù)量差異的原因。

3.3 稻蝦共作對(duì)稻田AOA 及AOB 群落多樣性的影響

景曉明[32]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施肥對(duì)黃泥田水稻土壤AOA 和AOB 群落多樣性影響不顯著，而方宇等[33]研究表明，長(zhǎng)期單施化肥提高了土壤AOA 的多樣性，而有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施降低了AOA 的多樣性；本研究結(jié)果顯示，稻蝦共作模式下稻田土壤AOA 群落多樣性發(fā)生顯著變化，然而AOB 群落多樣性無(wú)明顯變化。解開治等[34]研究表明，硝態(tài)氮、總氮、溫度、亞硝態(tài)氮這4 個(gè)環(huán)境因子對(duì)氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)演替及群落多樣性的影響最為顯著；Auguet 等[35]研究表明，氨氧化過(guò)程中硝態(tài)氮含量的變化會(huì)導(dǎo)致AOA 豐度及多樣性的變化。因此，稻蝦共作模式稻田土壤中硝態(tài)氮含量和全氮的含量的增加可能是土壤AOA 群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著性改變的主要原因。AOB由于較適應(yīng)這種偏堿性的環(huán)境[36]，對(duì)NH3具有較低的親和力，受銨態(tài)氮的含量影響較大，銨態(tài)氮沒有顯著變化，其多樣性指數(shù)及群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著變化。由于本研究只是針對(duì)短期稻蝦共作土壤的研究，土壤微生物群落多樣性在長(zhǎng)期進(jìn)行稻蝦共作的環(huán)境條件下的演變趨勢(shì)仍有待進(jìn)一步的研究論證。

3.4 稻蝦共作對(duì)稻田AOA 及AOB 群落組成與結(jié)構(gòu)的影響

目前，對(duì)于稻蝦共作中的土壤物理化學(xué)性質(zhì)的研究較多，然有關(guān)稻蝦共作模式對(duì)水稻土壤AOA與AOB 群落結(jié)構(gòu)影響的研究報(bào)道尚為不多。本研究結(jié)果表明稻蝦共作模式顯著改變了norank_c_environmental_samples_p_Crenarchaeota 與environmental_samples_f_Nitrosomonadaceae、norank_o_environmental_samples_c_Betaproteobacteria菌屬分別在AOA 與AOB 屬水平群落結(jié)構(gòu)中的相對(duì)豐度，導(dǎo)致AOA 與AOB 的群落結(jié)構(gòu)在屬水平上存在差異，且對(duì)AOB群落組成的影響強(qiáng)于AOA 群落結(jié)構(gòu)，這些差異可能是土壤類型或特定的稻田環(huán)境本身所決定的。前人研究表明，土壤pH[37]、土壤類型[38]以及NH3濃度[39]均可影響氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)。已有大量研究證實(shí)，堿性土壤背景有助于AOB 群落的生長(zhǎng)，酸性土壤條件下則AOA 表現(xiàn)得更為活躍，在本研究中，土壤pH 值處于7.4～7.5 之間，屬于中堿性土壤，這從一方面證實(shí)稻蝦共作引起AOB 群落差異且強(qiáng)度高于AOA 的原因。研究顯示[40]，pH 不是決定土壤中AOA 和AOB 生態(tài)位分離的唯一主要因素，同時(shí)氨濃度被認(rèn)為是決定酸性與堿性土壤中AOA和AOB 不同生態(tài)位的定義的關(guān)鍵因素。有研究報(bào)道在低pH 的土壤背景下，銨能夠解離的NH3越少卻更加適應(yīng)AOA 的生長(zhǎng)，相反AOB 的生長(zhǎng)活性會(huì)隨著NH3濃度的升高而增長(zhǎng)[39,41]。小龍蝦在養(yǎng)殖過(guò)程會(huì)有打洞爬行等擾動(dòng)行為，可加速土壤的轉(zhuǎn)化并增加土壤中的氧氣，而稻蝦田中小龍蝦產(chǎn)生的糞便、蝦殼等可為土壤提供有效的養(yǎng)分，提高NH3的含量，從而有助于AOB 的生長(zhǎng)，然而對(duì)AOA 群落結(jié)構(gòu)的影響小于AOB。另外，大量研究表明，氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)與土壤基本理化性質(zhì)之間有緊密的聯(lián)系[42-43]，經(jīng)過(guò)RDA 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)對(duì)AOA 與AOB 的微生物群落結(jié)構(gòu)的影響趨勢(shì)相同，其中硝態(tài)氮對(duì)AOA、AOB 微生物群落結(jié)構(gòu)影響最大，其次是總碳、銨態(tài)氮、堿解氮與pH。這說(shuō)明稻蝦共作對(duì)土壤氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)具有一定的影響。雖然土壤理化性質(zhì)對(duì)氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)影響存在一定的差異，但對(duì)于總體的變化還是一致的，證明土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物的群落的變化有直接的聯(lián)系。

4 結(jié)論

1) 稻蝦共作模式對(duì)水稻土壤基本理化性質(zhì)有一定的影響。在常規(guī)中稻種植模式與稻蝦共作模式中，稻蝦共作模式顯著提高了土壤硝態(tài)氮、總碳及總氮的含量，對(duì)土壤碳氮比、堿解氮、pH 無(wú)顯著影響。

2) 相比常規(guī)中稻種植模式，稻蝦共作模式顯著增加了稻田土壤氨氧化細(xì)菌與古菌的數(shù)量，AOA 與AOB 的數(shù)量分別增加了2.2 倍與1.8 倍，此外，在常規(guī)中稻模式與稻蝦共作模式下，氨氧化細(xì)菌的數(shù)量均顯著高于氨氧化古菌。

3) 較常規(guī)中稻種植模式，稻蝦共作模式對(duì)稻田土壤氨氧化細(xì)菌α 群落多樣性無(wú)顯著影響，但顯著降低了土壤氨氧化古菌的α 群落多樣性指數(shù)。

4) 稻蝦共作模式顯著改變了稻田土壤氨氧化細(xì)菌與古菌的群落組成與結(jié)構(gòu)。經(jīng)RDA 分析，硝態(tài)氮與土壤氨氧化微生物的數(shù)量、群落多樣性及結(jié)構(gòu)間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，是影響群落變化的環(huán)境主效因子。