姜建輝，周新，崔天伊，陳龍

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團南疆化工資源利用工程實驗室，新疆阿拉爾843300；2.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；3.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院，北京100029）

新疆黑蜂屬于高加索蜂種，在我國主要分布于新疆伊犁昭蘇縣、新源縣、尼勒克縣等地。黑蜂是一種具有較強的繁殖能力，抗病抗逆力強，產(chǎn)蜜、蠟、膠量高，在-30 ℃以下也能安全越冬的優(yōu)良蜂種。蜂王漿別名蜂乳、蜂皇漿、王漿，是工蜂舌腺和上顎腺等腺體的分泌物，有特殊刺激性氣味，專用于喂養(yǎng)蜂王成蟲和幼蟲的淡黃色或乳白色漿狀物質(zhì)。蜂王漿主要營養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、有機酸、維生素和酶，蜂王漿具有調(diào)節(jié)免疫功能[1-3]，延緩衰老[4-6]，抗菌抗炎[7-9]，防癌抗癌[10-12]，調(diào)節(jié)血壓[13-14]，降低血脂和血糖[15-16]等作用，其中抗氧化能力較為突出。研究發(fā)現(xiàn)蜂王漿水溶性蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性高于未水解蜂王漿水溶性蛋白的抗氧化活性，并且胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性是最強的[17-21]。本文根據(jù)經(jīng)典的Osboren 分類，從新疆黑蜂蜂王漿中提取出球蛋白凍干粉，并且用胰蛋白酶在不同的反應(yīng)條件下分別進行酶解試驗，分別測定各條件下對DPPH·清除率、對亞油酸氧化的抑制能力和總抗氧化活性，從而尋找出不同體外抗氧化模型中新疆黑峰蜂王漿蛋白酶解物的最佳酶解條件。該結(jié)論可為新疆黑峰蜂王漿制品的高值化開發(fā)利用可以提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FA1004B 電子天平：鄭州寶晶電子科技有限公司；TD5Z 高速冷凍離心機：上海趙迪生物科有限公司；HJ8 集熱式恒溫磁力攪拌器：廣州滬瑞明儀器有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機：杭州聚同電子有限公司；HH.S21-4 數(shù)顯式恒溫水浴鍋：邢臺潤聯(lián)機械設(shè)備有限公司；D-9143B-1 電熱恒溫鼓風干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；TGL-16G 高速臺式離心機：北京市平建實驗室設(shè)備有限公司；KQ-100B 超聲波清洗器：上海市超聲儀器有限公司；UV2400 分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pHS-3C 精密pH 調(diào)節(jié)計：上海虹益儀器儀表廠有限公司。

新疆黑蜂蜂王漿：伊犁紅郡蜂業(yè)有限責任公司；石油醚（AR）、氯化鈉（AR）、無水乙醇（AR）、氫氧化鈉（AR）、無水氯化亞鐵（AR）：天津市致遠化學試劑有限公司；鹽酸：上海試劑一廠；亞油酸、磷酸緩沖液、總抗氧化試劑：北京索萊寶科技有限公司；2-苯基-苦阱基自由基（DPPH）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：Sigma 公司；胰蛋白酶（BAEE＞9 000 U/mg）：Inventrogen 公司；硫氰酸銨（AR）：山東西亞股份有限公司。

1.2 蜂王漿球蛋白的混合物制備

結(jié)合經(jīng)典的Osboren 分類，將新疆黑蜂蜂王漿粗蛋白分為水溶性蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白、谷蛋白。首先稱取318.43 g 蜂王漿于若干離心管中，調(diào)溫至-80 ℃冷凍10 h，冷凍干燥，得106.23 g 凍干粉。再將凍干粉用石油醚按 1 ∶10（g/mL）的比例浸提 3 次，得脫脂蜂王漿凍干粉98.68 g。取脫脂凍干粉用超純水按1 ∶10（g/mL）的比例在4 ℃浸提3 次，每次2 h，將總濾液用14 k 透析袋在超純水中透析12 h。取不溶物用2%的NaCl 按1 ∶10（g/mL）的比例在 4 ℃重復浸提 3 次，濾液用 3.5 k透析袋在超純水中透析12h，冷凍干燥得球蛋白4.09 g，用紫外吸收法估測蛋白純度＞80%[22-23]。

1.3 球蛋白酶解條件的優(yōu)化

1.3.1 溶液的配制

稱取3.00 g 球蛋白定容于150 mL 的容量瓶得到濃度為0.02 g/mL 蜂王漿球蛋白溶液；稱取200 mg 胰蛋白酶定容于100 mL 的容量瓶得到濃度為2 mg/mL 胰蛋白酶溶液，獲得球蛋白酶解產(chǎn)物（globulin enzymatic hydrolysis product，GEHP）。

1.3.2 pH 值對DPPH·的清除率的影響

取5 個試管分別加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王漿球蛋白溶液，用濃度0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各試管 pH 值分別為 6、6.5、7、7.5、8，按酶底比為 1%加入胰蛋白酶。在37 ℃恒溫水浴鍋中均反應(yīng)3 h，各試管均在沸水浴中滅活15 min，冷凍干燥。

1.3.3 時間對DPPH·的清除率的影響

取5 個試管分別加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王漿球蛋白溶液，用濃度0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各試管的pH 值均為7，按酶底比為1%（質(zhì)量分數(shù)）加入胰蛋白酶。在37 ℃恒溫水浴鍋中各試管的反應(yīng)時間分別為 1、2、3、4、5 h，各試管均在沸水浴中滅活 15 min，冷凍干燥。

1.3.4 溫度對DPPH·的清除率的影響

取5 個試管分別加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王漿球蛋白溶液，用濃度0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各試管的pH 值為7，按酶底比為1%（質(zhì)量分數(shù)）加入胰蛋白酶。在溫度為 27 、37、47、57、67 ℃ 的 5 個恒溫水浴鍋中均反應(yīng)4 h，各試管均在沸水浴中滅活15 min，冷凍干燥。

1.3.5 酶底比對DPPH·的清除率的影響

取5 個試管分別加入20 mL 0.02 g/mL 的蜂王漿球蛋白溶液，用濃度0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)各試管的pH 值為7，各試管按酶底比（質(zhì)量分數(shù)）為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%加入胰蛋白酶。在47 ℃恒溫水浴鍋中均反應(yīng)4 h，各試管均在沸水浴中滅活15 min，冷凍干燥。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH·清除試驗

將DPPH 溶于無水乙醇中，濃度為0.1 mmol/L。再取2 mL 0.1 mg/mL 不同酶解條件下的樣品，樣品中加入2 mL 0.1 mmol/L 的DPPH·無水乙醇溶液，混勻后在25 ℃下避光反應(yīng)30 min，在517 nm 下測定吸光值為Ai；空白管用2 mL 無水乙醇溶液代替DPPH·無水乙醇溶液加入2 mL 相同濃度的待測樣品，在517 nm 下測定吸光值為Aj；對照管用2 mL DPPH·無水乙醇溶液加入2 mL 去離子水代替樣品，在517 nm 下測定吸光值為A0；以等體積去離子水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。清除率按以下公式計算：

1.4.2 抑制亞油酸氧化法

取待測樣品和對照物各1 mL，分別加入1 mL 濃度為2.51%的亞油酸無水乙醇溶液，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）和1 mL 無水乙醇（針對待測樣品）或去離子水（針對對照物），密閉后放在暗處并保持37 ℃恒溫。取5 mL 上述混合液，加入5 mL 75%的乙醇溶液和5 mL 30%的NH4SCN，再加入5 mL 0.02 mol/L 已溶解于3.5%鹽酸的FeCl2溶液，精準反應(yīng)3 min 之后測定其在500 nm 處的吸光度，每隔24 h測定一次，共測7 d[24]。

1.4.3 總抗氧化能力測定方法

總抗氧化能力的測定反應(yīng)原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）產(chǎn)生藍色的Fe2+-TPTZ，隨后593 nm 測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力[24-25]。

配制0.1 mg/mL 新疆黑蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物各組分試樣，按照T-AOC 試劑盒說明進行試驗，試驗重復3 次，取平均值?？偪寡趸芰τ迷囼炛袠悠饭芘c對照管在593 nm 處的吸光度的差值大小進行比較。測定的吸光度的差值越大，總抗氧化能力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 球蛋白提取分離結(jié)果與分析

蜂王漿中蛋白質(zhì)成分見表1。

表1 蜂王漿中蛋白質(zhì)成分Table 1 The protein composition of royal jelly

試驗所得凍干粉為106.23 g，其中球蛋白的干粉質(zhì)量為4.09 g，脂類物質(zhì)占干粉的7.11%。測得蜂王漿中含水量為66.63%，理論數(shù)值為64.5%～69.5%[16]。

2.2 抗氧化能力測定結(jié)果與分析

2.2.1 DPPH·的清除能力

2.2.1.1 pH 值對DPPH·的清除率的影響

按酶底比為1 %（質(zhì)量分數(shù)）加入胰蛋白酶，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 h，研究不同pH 值對蜂王漿酶解產(chǎn)物清除DPPH·效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同pH 值對DPPH·清除能力Fig.1 DPPH·scavenging ability at different pH conditions

由圖1 可知，隨著pH 值的增加，黑峰蜂王漿球蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH·的能力先升高后降低。當pH值由6 增大到7.5 時，清除率逐漸升高，隨著pH 值的增大，球蛋白水解產(chǎn)物的清除率隨之迅速下降，表明最佳pH 值為7.5。

2.2.1.2 時間對DPPH·的清除率的影響

按酶底比為1%（質(zhì)量分數(shù)）加入胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 值為7.5，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)，研究不同水解時間對蜂王漿酶解產(chǎn)物清除DPPH·效果的影響，結(jié)果見圖2。

同樣，也可以進行定性的分析補充．利用將任務(wù)點打包發(fā)布的方法[9]，對附件提供的定價方案進行修改，可以將任務(wù)分布密度較大的地方價格調(diào)低，將偏遠地區(qū)和未完成的任務(wù)價格調(diào)高．可以將熱門任務(wù)和冷門任務(wù)打包在一起，讓會員一起去執(zhí)行，能夠有效避免大量任務(wù)無人做的情況發(fā)生．

圖2 不同反應(yīng)時間對DPPH·清除能力Fig.2 DPPH·scavenging ability at different reaction times

由圖2 可知，隨著水解時間的增加，黑峰蜂王漿球蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH·的能力緩慢升高，當水解時間為4 h 后清除率基本不變，故選4 h 為最佳水解時間。

2.2.1.3 溫度對DPPH·的清除率的影響

按酶底比為1%（質(zhì)量分數(shù)）加入胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 值為7.5，反應(yīng)4 h，研究不同水解溫度對蜂王漿酶解產(chǎn)物清除DPPH·效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，隨著水解溫度的增加，黑峰蜂王漿球蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH·的能力逐漸升高，當水解溫度為57 ℃時清除率最高，隨后清除率隨之下降，故選57 ℃為最佳水解溫度。

圖3 不同溫度對DPPH·清除能力Fig.3 DPPH·scavenging ability at different temperatures

圖4 不同E/S 對DPPH·清除能力Fig.4 DPPH·scavenging ability at different E/S

2.2.1.4 酶底比對DPPH·的清除率的影響

調(diào)節(jié)pH 值為7.5，在57 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)4 h，研究不同酶底比對蜂王漿酶解產(chǎn)物清除DPPH·效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，隨著酶底比的增加，黑峰蜂王漿球蛋白水解產(chǎn)物清除DPPH·的能力逐漸升高，當酶底比（E/S）為1.5%（質(zhì)量分數(shù)）時清除率最高，隨后清除率隨之下降，故選1.5%（質(zhì)量分數(shù)）為最佳酶底比。

2.2.2 蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物抑制亞油酸氧化作用

添加蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物的亞油酸-NH4SCNFeCl2反應(yīng)體系吸光度隨時間的變化見表2。

表2 添加蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物的亞油酸-NH4SCN-FeCl2 反應(yīng)體系吸光度隨時間的變化Table 2 The change of absorbency over time of linoleic acid-NH4SCN-FeCl2 reaction system with the addition of Honeycomb globulin enzymatic hydrolysis product

由表2 數(shù)據(jù)可知，與對照組相比較，不同條件下黑蜂蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物對亞油酸的氧化均有一定程度的抑制作用，從試驗數(shù)據(jù)判斷，在pH 值為7、溫度為 27 ℃、反應(yīng)時間為 3 h、E/S 為 2%（質(zhì)量分數(shù)）的時候?qū)営退岬囊种菩Ч顝姟?/p>

2.2.3 蜂王漿球蛋白酶解產(chǎn)物總抗氧化能力的測定

為考察各蜂王漿提取物在不同條件下酶解物的總抗氧化能力，進行測定試驗，如圖5 所示。

由圖5 可知，不同酶解條件下的新疆黑蜂蜂王漿球蛋白的酶解產(chǎn)物均具有一定的總抗氧化能力，試驗數(shù)據(jù)表明：在反應(yīng)條件溫度為 47 ℃，pH 為 7，E/S 為2%（質(zhì)量分數(shù)），反應(yīng)時間為3 h 時總抗氧化能力最強。

圖5 不同酶解產(chǎn)物總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capabilities of different enzymatic products

3 結(jié)論與討論

綜合以上試驗的結(jié)果表明，新疆黑蜂蜂王漿中球蛋白的含量約占蜂王漿干重的3.9%。酶解后的蜂王漿球蛋白對DPPH·的清除能力最強的酶解條件是溫度為 57 ℃，pH 值為 7.5，E/S 為 1.5%（質(zhì)量分數(shù)），反應(yīng)時間為4 h。這一結(jié)果與總抗氧化能力和抑制亞油酸的氧化結(jié)果比較接近，因此可以推斷出在黑蜂蜂王漿球蛋白在溫度為 57 ℃、pH 值為 7、E/S 為 1.5%（質(zhì)量分數(shù)）、反應(yīng)時間為4 h 的條件下的抗氧化能力最強。試驗結(jié)果可為新疆黑峰蜂王漿的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)和試驗數(shù)據(jù)。