王維大，李碩，林薇，李玉梅，張連科，韓劍宏

內(nèi)蒙古科技大學能源與環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010

鉻是冶金、電鍍、印染、木材防腐及皮革制造等行業(yè)的重要原料，在其工業(yè)生產(chǎn)過程中，大量含鉻廢水被排入周邊環(huán)境中，對水體及土壤造成嚴重污染（Yong et al.，2011）。在環(huán)境中，鉻的形態(tài)主要以 Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)為主，Cr(Ⅵ)的遷移性和毒性強，且具有潛在的致畸和致突變作用（秦澤敏等，2016），而Cr(Ⅲ)毒性較低，在堿性條件下易形成氫氧化鉻沉淀，因此，在修復Cr(Ⅵ)的污染方法中往往先將 Cr(Ⅵ)還原為 Cr(Ⅲ)。

目前，水體中Cr(Ⅵ)的還原方法主要有鐵還原法、電化學還原法及微生物還原法（湯潔等，2013）。鐵還原和微生物還原處理含鉻廢水是目前研究的熱點，其中零價鐵是一種標準電位為-0.44 V的強還原劑，因其具有較強表面反應活性和相對較低的價格，被廣泛應用于地下水中及土壤的重金屬的修復（Yang et al.，2017）。納米零價鐵顆粒容易產(chǎn)生團聚、沉淀的現(xiàn)象，導致與污染物的接觸面積減少，難以實際應用。同時，粒徑較大的零價鐵顆粒表面易被空氣氧化，表面形成鈍化層，造成反應后期去除率降低。金屬還原菌是一類以金屬離子為末端電子受體進行無氧呼吸的菌株。該無氧呼吸過程偶聯(lián)著有機或無機電子供體的氧化，可釋放能量，支持微生物生長。由于Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的地球化學豐度比較高，在自然界中只要有厭氧環(huán)境，幾乎都會發(fā)生異化Fe(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的還原現(xiàn)象。已報道的具有還原 Fe(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)能力的菌株有 Bacillus cereus、Pseudomonas sp.、 Acinetobacter sp.、 Shewanella oneidensis、Escherichia coli等（Sathishkumar et al.，2016；Tang et al.，2010）。但微生物還原存在周期長、易受重金屬抑制等缺點。為了提高微生物對Cr(Ⅵ)的耐受性和還原效果，往往通過將菌株固定化來提高其對Cr(Ⅵ)的耐受性，通過添加電子供體和電子穿梭體等物質(zhì)，來增加微生物調(diào)控重金屬離子價態(tài)的速度和效果。研究表明，高度多孔性和較高比表面積的生物質(zhì)炭可以作為微生物的載體，而鐵離子可以作為電子穿梭體，增加微生物代謝過程中的電子轉(zhuǎn)移，提高重金屬的還原效果。目前，有關(guān)以碳材料為載體，固定化微生物及負載零價鐵的研究已數(shù)見不鮮，而將三者融為一體、互存互促、構(gòu)成耦合循環(huán)體系的研究報道較少。

本研究通過將黑炭/零價鐵復合材料與金屬還原菌進行耦合，建立高效穩(wěn)定的耦合體系，考察耦合體系中Cr(VI)的去除效果及影響因素，并研究了耦合體系中鐵的動態(tài)變化，以期實現(xiàn)耦合體系還原-吸附一體化去除溶液中的Cr(VI)，為環(huán)境中Cr(VI)污染的修復奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 培養(yǎng)基

菌株所用液體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g·L-1，酵母 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1)，用 NaOH 和HCl調(diào)節(jié)pH值為7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中按每升溶液加入15 g的瓊脂獲得。將一定量過濾除菌后的重鉻酸鉀溶液注入LB培養(yǎng)基中獲得含Cr(Ⅵ)培養(yǎng)基。

1.1.2 鉻還原菌的篩選及鑒定

稱取1 g包頭市韓慶壩原鉻渣場周邊土壤樣品于已滅菌的100 mL生理鹽水中，采用10倍稀釋法將其稀釋后涂布在含Cr(Ⅵ)固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察單菌落特征，之后挑選不同形態(tài)特征的菌落進行分離純化，得到具有抗Cr(Ⅵ)能力的菌株。通過考察抗Cr(Ⅵ)菌株對Cr(Ⅵ)的還原能力，選擇最優(yōu)的菌株作為后續(xù)研究所用的鉻還原菌，對其進行16S rDNA基因的測序分析，將測得的細菌序列通過Blast在GenBank中進行相似性檢索，并構(gòu)建其菌種發(fā)育樹。

1.1.3 黑炭/零價鐵復合材料的制備

將玉米秸稈洗凈、自然晾干后，對其進行粉碎得到供試秸稈粉末。稱取40 g FeCl3·6H2O，溶于60 mL去離子水中，加入15 g供試秸稈粉末，采用攪拌器將其混合均勻后進行抽濾，濾渣于 80 ℃恒溫干燥箱干燥，干燥后的樣品放入剛玉坩堝中，置于管式爐中氮氣氛圍下以 10 ℃·min-1的升溫速率加熱至900 ℃，恒溫熱解2 h后，自然冷卻至室溫，即得黑炭/零價鐵復合材料。

1.2 實驗方法

取 100 mL含 Cr(Ⅵ)液體培養(yǎng)基，用 HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至相應值后加入0.1 g黑炭負載零價鐵材料。取培養(yǎng)24 h左右（OD600為1.2—1.6）的鉻還原菌培養(yǎng)液3mL接種至上述培養(yǎng)基中，放入振蕩器中在100 r·min-1轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)，定期取出混合培養(yǎng)液進行Cr(VI)濃度和蛋白質(zhì)含量的測定，計算 Cr(VI)去除率。實驗過程中考察不同初始Cr(VI)質(zhì)量濃度（100—400 mg·L-1）和不同 pH 值（4.0—9.0）的影響。所有實驗均設(shè) 3個平行樣。Cr(VI)的去除率：

R為Cr(Ⅵ)的去除率；ρ0為初始溶液中Cr(VI)質(zhì)量濃度（mg·L-1）；ρt為t時刻溶液中 Cr(VI)質(zhì)量濃度（mg·L-1）。

1.3 分析測試方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB 7467-87）于540 nm波長處測定六價鉻濃度；采用鄰菲羅啉分光光度法于510 nm波長處測定Fe(Ⅱ)含量；采用火焰原子吸收法測定樣品中總鉻、總鐵含量；采用 Bardford法測定體系中蛋白質(zhì)含量（李娟等，2000）；采用RTS-9型雙電測四探針法測量樣品的電導率；采用日立S-3400N型掃描電鏡（SEM）觀察樣品的形貌特征；采用ESCALAB 250型X射線光電子能譜分析儀（XPS）對樣品表面的元素組成和原子價態(tài)等進行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鉻還原菌及其性能分析

將所篩選出Cr(VI)還原性能最優(yōu)的菌株命名為GY-1。以27F、1492R為引物進行PCR擴增，并測定了其序列，經(jīng)16S rDNA基因測序及同源性比較，結(jié)果顯示該菌株的16S rDNA基因序列與Bacillussp.序列的相似性達到100%，因此，確定菌株GY-1為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。根據(jù)GY-1菌的16S rDNA序列與相關(guān)屬種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。圖2為菌株GY-1對Cr(VI)和Fe(III)還原能力的測定結(jié)果，由圖 2a可以看出，隨著反應時間的延長，溶液中Fe(Ⅱ)的含量逐漸在增加，100 h后二價鐵的含量為16.8 mg·L-1。由圖2b可知，當溶液中Cr(VI)質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，在反應過程中 Cr(VI)呈下降趨勢，Cr(III)呈上升趨勢，在48 h后Cr(VI)去除率為97.51%。結(jié)合圖2a和圖2b所得結(jié)果，說明菌株GY-1同時具備還原Fe (III)和Cr(VI)的能力，這與Shafique et al.（2016）和權(quán)海榮等（2016）的研究結(jié)果已一致。

圖1 菌GY-1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 16S rDNA phylogenetic tree of the strain GY-1

圖2 菌GY-1對Fe(III)和Cr(Ⅵ)的還原性能Fig. 2 Reduction performance of the strain GY-1 for Fe (III) and Cr (VI)

2.2 黑炭/零價鐵復合材料與菌GY-1耦合前后的SEM分析

由圖 3a可知，零價鐵顆粒較為均勻的鑲嵌到黑炭的表面孔隙中，形成黑炭/零價鐵復合材料。比表面積分析結(jié)果顯示，其比表面積為385.32 m2·g-1，孔徑、孔容積分別為4.37 nm、0.44 cm3·g-1，該條件為微生物的附著生長提供有利條件，同時也增加了材料與污染物的接觸面積（Vilar et al.，2007）。由 3b可知，菌 GY-1與黑炭/零價鐵復合材料結(jié)合緊密，說明黑炭/零價鐵復合材料作為一種載體材料，可較好地固定微生物菌株，為其生長提供適宜的微環(huán)境，以致其活性提高。同時黑炭/零價鐵復合材料的電阻率為 4.03 Ω·cm，具有良好的導電性，可以強化電子的遠程傳遞（Liu et al.，2012），加快對Cr(Ⅵ)的還原速率。對比反應前（c）和反應后（d）菌體形態(tài)可知，反應前復合材料表面附著的菌體長約1.5—3 μm，反應完成后，菌株個體長度變短，約1—2 μm，這可能是因為高濃度Cr(Ⅵ)對菌體產(chǎn)生脅迫作用所致。

圖3 黑炭/零價鐵復合材料及其與菌GY-1耦合反應前后的SEM圖Fig. 3 SEM image of chromium-reducing bacteria-biochar-loaded zero-valent iron coupling system before and after reaction

2.3 對比實驗

在pH為6，Cr(VI)初始質(zhì)量濃度為100 mg·L-1條件下，分別對比了黑炭/零價鐵復合材料、菌GY-1以及黑炭/零價鐵復合材料耦合菌GY-1對六價鉻的還原性能，所得結(jié)果如圖4所示。由圖可知，耦合體系中Cr(Ⅵ)去除率最高為99.83%，明顯優(yōu)于單獨使用黑炭/零價鐵復合材料和單獨使用菌GY-1的效果，其原因主要為黑炭/零價鐵復合材料在偏中性條件下鐵碳微電解反應速率較慢，對Cr(Ⅵ)的還原去除效果較差，而單一菌株容易受Cr(Ⅵ)的脅迫，從而對其活性產(chǎn)生一定的抑制作用，相比于游離微生物，被固定化的鉻還原菌處于高度密集狀態(tài)，微生物的穩(wěn)定性、抗毒性增強（李杰等，2008）。而耦合體系中，菌GY-1被固定后提高其對Cr(Ⅵ)脅迫作用的同時，生物炭表面的零價鐵也對Cr(Ⅵ)具有較好的還原效果，因此，二者耦合可實現(xiàn)優(yōu)勢互補，使Cr(Ⅵ)的去除率提高。

圖4 單因素和耦合體系分別對Cr(Ⅵ)去除的影響Fig. 4 Effect of single factor and coupling system on Cr(VI) removal

2.3.1 不同六價鉻初始濃度對耦合體系Cr(Ⅵ)去除的影響

本實驗考察了pH為6，Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度分別為100、200、400 mg·L-1的條件下，耦合體系對 Cr(Ⅵ)的還原效果以及對鉻還原菌活性的影響，所得結(jié)果如圖5所示。

從圖5a可以看出，Cr(Ⅵ)初始質(zhì)量濃度為100 mg·L-1條件下，耦合體系在24 h左右基本將溶液中Cr(Ⅵ)全部去除。在初始質(zhì)量濃度為200 mg·L-1和400 mg·L-1條件下，耦合體系去除效果明顯變差，96 h后Cr(Ⅵ)的去除率分別為74.92%和33.06%，說明Cr(Ⅵ)濃度越高，對微生物的生長抑制作用越強。反應48 h后測定耦合體系中蛋白質(zhì)含量，所得結(jié)果如圖5b所示。由圖5b可知，Cr(Ⅵ)濃度越高，反應體系中蛋白質(zhì)濃度越低，說明微生物菌體的數(shù)量越少，其原因主要為高濃度的Cr(Ⅵ)對細菌產(chǎn)生了一定的毒性，使得細菌生長明顯受到抑制，影響其對Cr(Ⅵ)去除效果。

2.3.2 不同溶液 pH 對耦合體系中 Cr(Ⅵ)的還原效果

微生物所處環(huán)境的 pH值對其生長代謝活性影響較大，pH通過影響細胞質(zhì)膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和物質(zhì)的溶解性或電離性來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的代謝活力（李杰等，2008）。本實驗考察了耦合體系初始 pH值范圍為 4.0—9.0對Cr(Ⅵ)的去除效果，所得結(jié)果如圖6所示。

由圖6a可知，在反應初始階段，pH值為4的條件下去除效率最高，此時主要為黑炭負載零價鐵的作用效果，即零價鐵對Cr(Ⅵ)的還原或生物炭的吸附作用。在酸性條件下，黑炭負載零價鐵作用效果明顯。由式（2）、式（3）可知，

圖5 不同初始質(zhì)量濃度下耦合體系Cr(VI)去除率和蛋白質(zhì)含量Fig. 5 Cr(VI) removal rate and protein content of the coupling system at different initial concentrations

圖6 不同初始pH值下耦合體系Cr(VI)去除率和蛋白質(zhì)含量Fig. 6 Cr(VI) removal rate and protein content of the coupling system at different initial pH values

H+參與反應并且會被消耗，H+可以促進Fe0與Cr(Ⅵ)的反應。結(jié)合圖6b可知，在pH值為4的條件下，蛋白質(zhì)含量最少，說明在該條件下，Cr(Ⅵ)對鉻還原菌產(chǎn)生了毒性，其生長受到抑制。隨著反應的進行，鉻還原菌的不斷生長，在初始pH值為7的條件下，Cr(Ⅵ)去除效果最好，在24 h時去除率便可以達到95.86%。在48 h時，相比于其他pH值條件下，蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度最高，達到 183.77 mg·L-1。在整個培養(yǎng)過程中，隨著時間的增加，在初始pH值為6的條件下，耦合體系也表現(xiàn)出了較好的去除效果，在 48 h時，Cr(Ⅵ)去除率達到99.03%。雖然細菌在初始pH值為6的條件下蛋白質(zhì)含量低于初始pH值為7的條件下，但是兩者最終的去除率相近，這可能是因為細菌的還原酶在該條件下對Cr((Ⅵ)具有較好的還原效果。另外，在初始pH值為9的條件下，耦合體系前期對Cr(Ⅵ)去除效果較差，隨著鉻還原菌對環(huán)境的不斷適應，反應 48h后蛋白質(zhì)含量為 106.77 mg·L-1，且后期Cr(Ⅵ)的去除率有所提高，最高達89.55%。不難看出，溶液的pH值不但會影響細菌的生長繁殖，而且會對耦合體系去除溶液中的Cr(VI)產(chǎn)生影響。

圖7 C(VI)去除過程中pH值的變化Fig. 7 Change in pH during removal of C(VI)

在該實驗過程中，對體系中pH值變化情況進行了監(jiān)測，結(jié)果如圖7所示。在初始值為4和5的條件下，經(jīng)過48 h，整個培養(yǎng)過程中體系pH值升高1左右，但仍為酸性環(huán)境。這可能由于零價鐵在酸性環(huán)境下腐蝕速率加快，體系中OH-離子大幅度增加，所以pH出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。在初始pH值為6、7和8的條件下，6 h時pH值均在7左右，48 h后均趨于8。初始pH值為9時，6 h后pH稍有下降，但經(jīng)過48 h后，pH也趨于8。這可能與細菌在生長過程中的分泌物質(zhì)有關(guān)，能夠自主的調(diào)節(jié)溶液中pH值，同時，體系中pH值的改變也說明了細菌對環(huán)境具有適應能力。另外，由于耦合體系中黑炭負載零價鐵的存在，對菌株起到了一定的保護作用，有助于緩沖外界pH值對鉻還原菌的影響。

2.4 耦合體系鐵的動態(tài)變化

本實驗在初始Cr(Ⅵ)質(zhì)量濃度為100 mg·L-1，pH值為 6的條件下，以單獨黑炭負載零價鐵組作為對比，測定Fe(Ⅱ)及總Fe的濃度變化，所得結(jié)果如圖8所示。

圖8 Cr(VI)去除過程中鐵的質(zhì)量濃度變化Fig. 8 Variation of iron concentration during Cr(VI) removal

由圖8可知，反應過程中的鐵離子主要由溶出的為Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)組成。6 h時耦合體系與黑炭負載零價鐵中Fe(Ⅱ)和總Fe的含量相差不大。隨著時間的變化，菌體數(shù)量增加，耦合體系Fe(Ⅱ)的含量逐漸增加，且明顯多于黑炭/零價鐵復合材料組。24 h時耦合體系中Fe(Ⅱ)的含量達到最大，約為18.16 mg·L-1，此時 Cr(VI)的去除率已達到 95.47%（圖 5），黑炭/零價鐵復合材料中 Fe(II)的含量約為 11.46 mg·L-1，說明鉻還原菌可能將零價鐵表面鈍化層的Fe(Ⅲ)還原為 Fe(Ⅱ)，F(xiàn)e(Ⅱ)繼續(xù)參與還原反應，還原產(chǎn)物 Cr(Ⅲ)最終以鐵鉻氧化物的形式沉淀下來。隨著時間的延長，黑炭負載零價鐵中總Fe的含量相對穩(wěn)定，而耦合體系中總Fe的含量開始有所下降，說明菌體不但具有Fe還原能力，而且會吸附溶液中的鐵離子，導致總Fe的含量降低。黑炭負載零價鐵與鉻還原菌相耦合，一方面，黑炭負載零價鐵可作為菌株生長繁殖的場所；另一方面，微生物能還原零價鐵鈍化層的 Fe(Ⅲ)為 Fe(Ⅱ)，生成的 Fe(Ⅱ)既能參與還原 Cr(VI)，產(chǎn)生循環(huán)效果。此外，鐵離子可以作為一種電子傳遞介質(zhì)增強零價鐵與 Cr(VI)之間的電子傳輸，加速反應的進行，解決零價鐵鈍化層問題（2018），增強協(xié)同體系去除Cr(VI)的效果。

2.5 耦合體系XPS分析

圖9 反應前后耦合體系的全譜分析（a、b）及反應后Fe(2p)和Cr(2p)的（c和d）XPS譜圖Fig. 9 Full spectrum analysis of the coupled system before and after the reaction (a， b) and the (c and d) XPS spectra of Fe(2p) and Cr(2p) after the reaction

為了進一步說明黑炭/零價鐵復合材料與金屬還原菌耦合體系對Cr(Ⅵ)的去除機理，待反應進行48 h后，采用XPS對去除Cr(Ⅵ)前后的材料進行表征分析，分峰擬合后，如圖9所示。耦合體系的全譜圖中，明顯出現(xiàn)了C1s、O1s、N1s和Fe 2p軌道的特征峰。在反應前，這些元素的結(jié)合能大約C1s 284.45 eV，N1s 402.08 eV，O1s 532.29 eV，F(xiàn)e2p 711.20 eV，在與 Cr(VI)反應 48h后，在 Cr2p 577.24eV很明顯出現(xiàn)了一個新的峰值，證明了耦合體系中產(chǎn)生了鉻的積累。圖（c）為耦合體系的Fe(2p)XPS譜圖，在709.83、711.19、713.29、717.95、723.84、726.88 eV處對應Fe (2p 3/2)和Fe (2p 1/2)的結(jié)合能。在709.83、713.29、726.88 eV處對應為Fe(Ⅱ)的衛(wèi)星峰，在 711.19、717.95、723.84 eV 處均表現(xiàn)為Fe(III)特征（Yamashita et al.，2008），是因為黑炭/零價鐵復合材料中的零價鐵被氧化生成三價鐵化合物。圖9d為Cr(Ⅵ)還原后耦合體系的Cr (2p) XPS譜圖，Cr (2p)譜圖顯示有兩對峰，說明鉻離子以兩種形式存在，586.40、577.89 eV處分別對應于Cr (2p 1/2)和Cr (2p 3/2)軌道，Cr (2p 3/2)可以進一步分峰（Pan et al.，2014；Park et al.，2008），其中在 Cr(Ⅵ)位于 577.89 eV，占比 25.75%，Cr(Ⅲ)分別位于576.44、586.40 eV，占33.57%和40.68%。這說明，Cr(Ⅵ)和 Cr(Ⅲ)可能會共同存在于耦合體系之中，但大部分的 Cr(Ⅵ)會被零價鐵和鉻還原菌還原為Cr(Ⅲ)。

3 結(jié)論

（1）從污染土壤中篩選出1株具有鉻還原能力的菌株（編號GY-1）。通過16S rDNA鑒定，該鉻還原菌為蠟樣芽孢桿菌。

（2）黑炭/零價鐵復合材料可作為固定化載體，為微生物生長提供更好的場所，被固定化的鉻還原菌穩(wěn)定性、抗毒性增強。耦合體系的初始 pH為 7和8時，適合菌株的生長，并具有較高的Cr(Ⅵ)去除效果。細菌在生長過程中的分泌物質(zhì)能夠自主調(diào)節(jié)溶液中pH值。

（3）通過測定耦合體系Fe(Ⅱ)及總Fe的濃度變化，說明微生物能還原零價鐵鈍化層的 Fe(Ⅲ)為Fe(Ⅱ)，生成的 Fe(Ⅱ)繼續(xù)參與反應還原 Cr(Ⅵ)，產(chǎn)生循環(huán)效果

（4）通過XPS分析對去除Cr(Ⅵ)前后的材料進行表征分析，證明了反應后零價鐵被氧化生成Fe(Ⅲ)化合物，大部分的 Cr(Ⅵ)會被零價鐵和鉻還原菌還原為Cr(Ⅲ)。