梁嘉穎 鄭毅春 張杰 黃志承 張曦倩

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科（廣州510010）

選擇合適的精子優(yōu)選方法是輔助生殖技術(shù)成功的重要條件之一。優(yōu)選技術(shù)能將精子從精漿中分離出來，對精子獲能十分重要，但精子在受精培養(yǎng)基中的染色體不規(guī)則變化也會對受精和胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響［1］，精子核DNA 碎片含量與受精率和植入率呈負相關(guān)，與流產(chǎn)率和部分后代疾病發(fā)病率呈正相關(guān)［2］。此類染色體結(jié)構(gòu)變化無法通過精子濃度，活動力和形態(tài)學等檢查進行評估，因此，有效的優(yōu)選技術(shù)不僅能篩選出高活力精子，還應(yīng)回收到內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整和受精功能良好的精子。

非連續(xù)密度梯度離心法是世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊第5 版［3］（簡稱“WHO第5 版”）推薦的精子優(yōu)選方法。使用不同體積、濃度和層數(shù)的梯度液能回收不同質(zhì)量的精子［4］。目前對單層密度梯度離心法的臨床評價不一，部分學者認為單層法具有試劑用量少和操作簡便的優(yōu)點，并可提高精子回收率和活動率［5］；也有研究指出，單層法優(yōu)選后的精子活力與優(yōu)選前無顯著差異［6］。此外，密度梯度離心法對精子細胞DNA完整性的影響亦存爭議，一些研究表明其可有效分離存在缺陷DNA 和低聚染色質(zhì)的精子［7］，90%梯度液界面的精子DNA 完整性顯著優(yōu)于70%界面［8］；有研究［9］則顯示，其在選擇高雙鏈DNA 完整性的精子方面并不起作用。

本研究目的是比較單層（70%）和雙層（45%+90%）密度梯度離心法優(yōu)選后的精子質(zhì)量，包括活動精子回收率、精子形態(tài)、DNA 碎片和成熟度等的差異，及其行夫精宮腔內(nèi)人工授精（artificial insemination with husband′s sperm，AIH-IUI）的臨床妊娠率，以期綜合評估單層和雙層密度梯度離心法的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)收集500 例（正常精子100例、輕度少精子癥和輕度弱精子癥各200 例）于2018年1月至12月在廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科行AIH-IUI 治療的男性精液標本。診斷標準參照WHO 第5 版標準，正常精子：精液體積≥1.5 mL，精子濃度≥15 × 106/mL 或精子總數(shù)≥39 × 106，前向運動精子百分率（PR）≥32%，正常形態(tài)精子百分率（NP）≥4%；輕度少精子癥：10 ×106/mL≤精子濃度＜15 × 106/mL；輕度弱精子癥：20% ≤PR% ＜32%［3］。所有受試者均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

受試者年齡、精液體積、精子濃度、PR%、（PR+NP）%、誘發(fā)頂體反應(yīng)率（AR）、DNA 碎片化指數(shù)（DFI）、成熟度和精液白細胞濃度等指標組間差異見表1。

表1 各組受試者精液標本參數(shù)Tab.1 The baseline semen samples characteristics of different groups±s

表1 各組受試者精液標本參數(shù)Tab.1 The baseline semen samples characteristics of different groups±s

注：與其他兩組比較，*P ＜0.05

精液參數(shù)年齡（歲）體積（mL）精子濃度（×106/mL）PR（%）PR+NP（%）正常形態(tài)精子百分率（%）AR（%）DFI（%）精子成熟度（%）白細胞濃度（×106/mL）正常精子（n=100）32.0±4.1 2.51±1.01 49.11±22.34 46.21±7.17 64.55±8.17 3.01±1.49 6.86±1.43 17.30±9.69 65.31±12.28 0.63±0.18輕度少精子癥（n=200）31.4±3.9 1.59±0.85*25.82±9.38*48.50±7.38 66.67±12.75 2.70±1.81 6.42±1.31 17.58±4.37 66.94±10.32 0.98±0.79輕度弱精子癥（n=200）31.7±2.8 2.96±1.09 51.45±23.28 27.29±4.89*46.94±9.05*3.13±1.90 7.17±1.43 18.67±6.85 65.23±12.59 0.67±0.58 F 值1.274 9.478 6.814 159.630 91.200 0.371 1.498 1.358 0.062 0.484 P 值0.206＜0.001 0.001＜0.001＜0.001 0.690 0.225 0.337 0.940 0.617

1.2 試劑瑞典Vitrolife 公司的SpermGrad、SpermRinse 和GIVF；珠海貝索生物技術(shù)有限公司的精子（細胞）形態(tài)學Diff-Quik 快速染色液；南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責任公司的白細胞過氧化物酶染色試劑盒；深圳博銳德生物科技有限公司的SCD 法精子DNA 碎片檢測試劑盒和固相捕獲法精子透明質(zhì)酸結(jié)合試驗試劑盒等。

1.3 主要儀器西班牙Microptic 公司的SCA 計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）；日本Olympus 公司的BX53 普通光學顯微鏡；德國Eppendorf 公司的移液器；上海齊欣科學儀器有限公司的CU-600 電熱恒溫水浴箱等。

1.4 方法

1.4.1 精液采集受檢者禁欲2～7 d，手淫方式采集精液于潔凈無菌一次性采精杯中，記錄采集時間，放置37 ℃孵育箱20 min。

1.4.2 精液常規(guī)檢測記錄精液體積、pH 值、性狀等，CASA 系統(tǒng)檢測精子濃度、PR 和PR+NP，并自動算出精子總數(shù)、PR 精子總數(shù)和PR+NP 精子總數(shù)。計算值：PR 精子回收率（%）=優(yōu)選后PR 精子總數(shù)/優(yōu)選前PR 精子總數(shù)×100%，PR+NP 精子回收率（%）=優(yōu)選后PR+NP 精子總數(shù)/優(yōu)選前PR+NP 精子總數(shù)×100%。

1.4.3 精子形態(tài)分析采用Diff-Quik 染色法，普通光學顯微鏡下1000×倍油鏡觀察分析至少200條精子，計數(shù)正常形態(tài)和異常形態(tài)（頭部缺陷、頸部和中段缺陷、主段缺陷和過量殘留胞漿ERC 等）精子數(shù)，并計算出正常形態(tài)精子百分率。

1.4.4 指標觀察精子誘發(fā)頂體反應(yīng)率（AR）、DNA 碎片化指數(shù)（DFI）、成熟度和精液白細胞濃度分析均嚴格按照各試劑盒操作規(guī)程進行。

1.4.5 精液優(yōu)化處理精液液化后，制備1 mL＋1 mL 90%＋45% SpermGrad 雙層梯度液或2 mL 70%SpermGrad 單層梯度液，小心在最上層加入不超過2 mL 精液；340×g離心20 min 后棄上清，吸取底部沉淀，置5 mL SpermRinse 中混勻，340×g離心8 min 后棄上清，吸取底部沉淀置0.6 mL GIVF 液中混勻作授精液，記錄每份精液優(yōu)選后的精子濃度、PR 和PR+NP，計算回收率；留取0.1 mL 作精子功能檢測，其余根據(jù)WHO 第5 版［3］和前期研究結(jié)果［10］，置5%CO2、37 ℃、95%濕度培養(yǎng)箱孵育20 ～40 min，行AIH-IUI 手術(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本組比較采用方差分析，兩兩組間比較采用q檢驗，成對樣本比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常精子組精液優(yōu)化處理前后參數(shù)比較正常精子組精液經(jīng)優(yōu)選后，單層法（45 份）精子濃度高于雙層法（55 份），PR%和PR 精子回收率低于雙層法（P＜0.05），兩種方法的PR + NP 和PR + NP精子回收率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經(jīng)兩種方法優(yōu)選后，正常形態(tài)精子百分率、AR、DFI、成熟度和精液白細胞濃度等指標，與優(yōu)選前的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 正常精子組精液經(jīng)兩種密度梯度方法處理前后的精子參數(shù)對比Tab.2 Semen parameters by two gradient centrifugation in group normozoospermia ±s

表2 正常精子組精液經(jīng)兩種密度梯度方法處理前后的精子參數(shù)對比Tab.2 Semen parameters by two gradient centrifugation in group normozoospermia ±s

注：與優(yōu)選前比較，*P ＜0.05

精液參數(shù)精子濃度（×106/mL）PR（%）PR 精子回收率（%）PR+NP（%）PR+NP 精子回收率（%）正常形態(tài)精子百分率（%）AR（%）DFI（%）精子成熟度（%）白細胞濃度（×106/mL）優(yōu)選前單層法47.69±19.39 46.27±5.9363.58±6.362.67±1.32 6.85±1.25 15.15±7.82 67.13±9.84 0.85±0.41雙層法50.73±22.78 46.19±7.4764.80±8.563.10±1.52 6.87±1.48 17.73±9.98 64.90±12.76 0.57±0.12 t 值0.407 0.0741.1751.909 0.072 1.353 0.957 1.503 P 值0.617 0.941