王志君，陳禮治，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)是在氟康唑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成的三唑類廣譜抗真菌藥，臨床上主要用于治療由曲霉菌、念珠菌、隱球菌和組織胞漿菌引起的系統(tǒng)性真菌感染，也可用于治療肝移植術(shù)后的侵襲性真菌感染。伏立康唑在水中幾乎不溶解，美國輝瑞制藥公司研制開發(fā)的注射用伏立康唑中采用磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(陰離子型高水溶性環(huán)糊精衍生物)包合藥物分子，形成非共價(jià)復(fù)合物，可增加其溶解性，提高藥物的穩(wěn)定性和水溶性。四川美大康華康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用伏立康唑，采用專用溶媒(乙醇∶丙二醇=1∶1)溶解伏立康唑后，再將溶液加至生理鹽水中。伏立康唑的血藥濃度測(cè)定方法如高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，同時(shí)有深入的藥動(dòng)學(xué)研究[3]，以及不同輔料對(duì)伏立康唑影響的研究[4-5]，但伏立康唑氮氧化物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較少[6]。本研究建立了同時(shí)測(cè)定伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的HPLC-MS/MS法，并考察大鼠注射不同溶媒制備的伏立康唑注射劑后，伏立康唑及其代謝物伏立康唑氮氧化物在大鼠體內(nèi)的組織分布。

1 材料和方法

1.1 儀器 G6410A液質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent Mass Hunter分析軟件[安捷倫科技(中國)有限公司]；XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；5804R低溫冷凍離心機(jī)(轉(zhuǎn)子型號(hào)F45-30-11，離心半徑95 mm)、MiniSpin離心機(jī)(離心半徑60 mm，Eppendorf中國有限公司)；AG285電子分析天平、PB-10酸度計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2 試劑和藥品 伏立康唑?qū)φ掌?純度99.2%，批號(hào)100862-201402)、氟康唑?qū)φ掌?純度99.7%，批號(hào)100314-201605)均購自中國食品藥品檢定研究院；伏立康唑氮氧化物(純度99.7%,Toronto Research Chemicals Inc.，批號(hào)Ch 100314-201605)；注射用伏立康唑A(0.1 g/瓶，四川美大康華康藥業(yè)有限公司，批號(hào)18042219，專用溶媒批號(hào)18042826)；注射用伏立康唑B(0.2 g/瓶，美國輝瑞制藥有限公司，批號(hào)2521601)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸和乙酸銨等其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.3 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量170～230 g，清潔級(jí),購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0002]，飼養(yǎng)溫度(23±2) ℃，濕度45%～75%，每12小時(shí)交替照明，自由飲水、飲食。

1.4 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為ACE C18-AR柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%乙酸水溶液(內(nèi)含20 mmol/L乙酸銨)，體積比為80∶20；流速0.5 ml/min；進(jìn)樣量1 μl；柱溫40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)；在正離子檢測(cè)方式下選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析；質(zhì)譜檢測(cè)：毛細(xì)管電壓3.6 kV；霧化器壓力206.8 kPa(30 psi)；離子源溫度100 ℃，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min。用于定量分析中的離子反應(yīng)：伏立康唑[M+H]+m/z350.2(母離子)→281.0 (子離子),裂解器電壓和碰撞能量分別為124 V和12.0 eV；伏立康唑氮氧化物[M+H]+m/z366.1(母離子)→224.0(子離子)，其裂解器電壓和碰撞能量分別為100 V和8.0 eV；氟康唑[M+H]+m/z307.1(母離子)→220.1(子離子)，其裂解器電壓和碰撞能量分別為130 V和14.0 eV。

1.5 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 稱取伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和內(nèi)標(biāo)氟康唑?qū)φ掌犯?0 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的3種對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4～8 ℃冰箱，備用。

1.6 樣品采集

1.6.1 血漿樣品 取12只大鼠，以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成兩組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑[7]，于給藥前，給藥后5、30 min，1、2、4、6、8、12、24 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血約0.5 ml，置于肝素化EP管中，604×g離心5 min后取血漿，于-80 ℃保存，備用。

1.6.2 組織樣品 取60只大鼠，隨機(jī)分成兩組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行設(shè)定3只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑，于給藥前，給藥后5、30 min，1、2、4、6、8、12、24 h處死大鼠，取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦組織，洗去殘余血液，去除多余的結(jié)締組織，用生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱重。

1.7 樣品前處理

1.7.1 組織勻漿上清液的制備 精密稱取各組織1.0 g，不足1.0 g取全量，加入2 ml生理鹽水制備組織勻漿，將組織勻漿以1.13×104×g離心5 min，取上清液，即為組織勻漿上清液，置于-80 ℃低溫冰箱備用。

1.7.2 血漿和組織勻漿上清液樣品的前處理 取待處理血漿和組織勻漿上清液樣本各200 μl，加入甲醇溶液600 μl，振蕩2 min，1.13×104×g離心10 min，取200 μl上清液置EP管中，再加入0.2%乙酸溶液(含50 mmol/L乙酸銨)和甲醇溶液(含5 μg/ml內(nèi)標(biāo))各200 μl，渦旋混合20 s，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，按1.4項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。

1.8 動(dòng)物行為觀察 取12只大鼠，隨機(jī)分成兩組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑，分別于給藥后24 h觀察動(dòng)物行為，記錄大鼠是否身體殘缺、相互攻擊或死亡等。

1.9 數(shù)據(jù)處理 采用Phoenix WinNolin 64(版本8.1.0.3530)數(shù)據(jù)處理軟件的非房室模型，以統(tǒng)計(jì)矩法進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算，采用R軟件3.5.1版本做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，組織分布的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜分析 取伏立康唑?qū)φ掌啡芤?20 μg/ml)、伏立康唑氮氧化物對(duì)照品溶液(20 μg/ml)和內(nèi)標(biāo)氟康唑溶液(5 μg/ml)，進(jìn)行碎片分析，得到二級(jí)質(zhì)譜掃描圖，見圖1。

2.2 方法專屬性 分別取空白血漿、加入混合對(duì)照品的模擬血漿樣品和給藥后1 h的血漿樣品，按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟康唑、伏立康唑氮氧化物和伏立康唑的保留時(shí)間分別為3.2、3.3和3.9 min，見圖2。空白血漿和流動(dòng)相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)值的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的5%，表明雜質(zhì)對(duì)3種組分的測(cè)定無干擾。

圖1 伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和氟康唑的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrograms of voliconazole,voliconazole nitrogen oxides and fluconazoleA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；C：氟康唑

圖2 伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和氟康唑的HPLC-MS/MS譜圖Figure 2 HPLC-MS/MS chromatograms of voriconazole,voriconazole nitrogen oxides and fluconazole A:空白血漿；B:空白血漿+混合對(duì)照品溶液；C:血漿樣品(給藥后1 h)；1：伏立康唑氮氧化物；2：伏立康唑；3：氟康唑

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取大鼠空白血漿，心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織的組織勻漿液各200 μl，分別精密加入不同濃度的混合對(duì)照品溶液，得到系列對(duì)照組織樣品，制備含伏立康唑、伏立康唑氮氧化物分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40 μg/ml的系列對(duì)照血漿和組織樣品，按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)。以伏立康唑或伏立康唑氮氧化物與內(nèi)標(biāo)氟康唑面積的比值(y)對(duì)血漿濃度(x)進(jìn)行線性回歸，從而得到線性回歸方程。結(jié)果表明，所測(cè)成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 大鼠血漿和組織中伏立康唑和伏立康唑 氮氧化物的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of voriconazole and voriconazole nitrogen oxides in rat plasma and tissues (n=11)

2.4 定量限和最低檢測(cè)限 按照樣品處理方法，配制系列不同濃度的血漿樣品溶液，進(jìn)行樣品處理后進(jìn)樣分析。以信噪比(S/N)≥10的檢測(cè)濃度作為定量限，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的定量限分別為0.6和10 ng/ml。以S/N≥3的檢測(cè)濃度為最低檢測(cè)限，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最低檢測(cè)限分別為0.2和2.5 ng/ml。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)

2.5.1 批內(nèi)回收率和精密度 取200 μl大鼠空白血漿及200 μl各組織空白勻漿液配制以下系列濃度樣品：(1)伏立康唑定量下限(血漿為0.02 μg/ml，組織為0.01 μg/ml)、低濃度(0.05 μg/ml)、中濃度(2 μg/ml)、高濃度(血漿為40 μg/ml，組織為20 μg/ml)；(2)伏立康唑氮氧化物定量下限(血漿、腎臟、腦組織為0.02 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為0.05 μg/ml)，低濃度(血漿、腎臟、腦組織為0.05 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為0.1 μg/ml)，中濃度(血漿、腎臟、腦組織為1 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為2 μg/ml)，高濃度(血漿為40 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為5 μg/ml，腎臟、腦組織為2 μg/ml)。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定質(zhì)控樣品的絕對(duì)回收率。絕對(duì)回收率=實(shí)測(cè)濃度/實(shí)際加樣濃度×100%。結(jié)果表明，伏立康唑批內(nèi)回收率>85%，RSD<9.6%(n=5)；伏立康唑氮氧化物批內(nèi)回收率>87.2%，RSD<8.1%(n=5)。

2.5.2 批間回收率和精密度 分別配制3批2.5.1項(xiàng)下4種濃度的質(zhì)控血漿和各組織樣品殘?jiān)鼜?fù)溶液，每一濃度取5個(gè)樣本，按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，分3 d進(jìn)行測(cè)定，把測(cè)定的峰面積代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品的回收率。結(jié)果表明，伏立康唑批內(nèi)回收率>88.5%，RSD<7.7%(n=5)；伏立康唑氮氧化物批內(nèi)回收率>89.1%，RSD<8.6%(n=5)。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低濃度(0.02 μg/ml)、高濃度(40 μg/ml)的血漿樣品，分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。(1)凍融實(shí)驗(yàn)：冰凍溫度-80 ℃，解凍溫度25 ℃，反復(fù)凍融3次，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。(2)長(zhǎng)期冷凍實(shí)驗(yàn)：將含藥血漿樣品于-80 ℃放置1個(gè)月后進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。(3)血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：將血漿樣品按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，室溫下保存48 h，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，每一濃度取5個(gè)樣本，把測(cè)定的峰面積代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，在3種穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，伏立康唑的回收率>91.5%，RSD<8.6%(n=5)；伏立康唑氮氧化物的回收率>93.1%，RSD<9.1%(n=5)。表明血漿樣品反復(fù)3次凍融后穩(wěn)定性良好；血漿樣品在-80 ℃條件下至少可以保存1個(gè)月；血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h。結(jié)果顯示，待測(cè)組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性符合生物樣品的檢測(cè)要求。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)考察 取6批空白血漿，制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低濃度(0.02 μg/ml)、高濃度(40 μg/ml )的血漿樣品，按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，每一濃度取5個(gè)樣本，把測(cè)定的峰面積代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率。伏立康唑的RSD<9.2%，伏立康唑氮氧化物的RSD<10.1%(n=5)。

2.8 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 把12只Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，分別從尾靜脈注射兩種伏立康唑注射劑后，于系列時(shí)間點(diǎn)取血漿，按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表2，平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線圖見圖3。采用t檢驗(yàn)對(duì)AUC0～24 h進(jìn)行比較，結(jié)果無顯著性差異(伏立康唑P=0.144 8，伏立康唑氮氧化物P=0.860 8)，表明兩種伏立康唑注射劑的AUC0～24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.9 組織分布實(shí)驗(yàn) 精密吸取組織勻漿液按1.7項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，按1.4項(xiàng)的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測(cè)，把測(cè)定的峰面積帶入線性回歸方程，計(jì)算出給藥后大鼠各組織中伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度和藥-時(shí)曲線下面積。各組織勻漿上清液中伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的藥物濃度-時(shí)間曲線見圖4，各組織中24 h藥物濃度-時(shí)間曲線下面積見圖5。由圖5可見，24 h內(nèi)伏立康唑的組織藥物累積濃度由大到小依次為肝臟>脾臟>心臟>腎臟>肺>腦組織，伏立康唑氮氧化物的組織藥物累積濃度由大到小依次為心臟>脾臟>肺>肝臟>腎臟>腦組織。兩種伏立康唑注射劑在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織的總體暴露未見顯著性差異(P>0.05)，不排除在特定臟器中可能存在顯著性差異。

表2 兩種伏立康唑注射劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of two kinds of voriconazole injections in rats (n=6)

CL：清除率；AUC0～24 h：24 h藥物濃度-時(shí)間曲線下面積；AUMC：一階曲線下面積；MRT：平均滯留時(shí)間

圖3 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線圖Figure 3 Average plasma drug concentration-time curves of voriconazole and voriconazole nitrogen oxidesA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；○：國產(chǎn)制劑；●：進(jìn)口制劑；

圖4 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在組織勻漿上清液中的藥物濃度-時(shí)間曲線Figure 4 The average drug concentration-time curves of voriconazole and voriconazole nitrogen oxides in tissue homogenate supernatantA：心臟；B：肝臟；C：脾臟；D：肺 E：腎臟；F：腦組織;○：伏立康唑(國產(chǎn)制劑)；●：伏立康唑(進(jìn)口制劑); △：伏立康唑氮氧化物(國產(chǎn)制劑);▲：伏立康唑氮氧化物(進(jìn)口制劑)；

圖5 各組織中24 h藥物濃度-時(shí)間曲線下面積Figure 5 Area under the curve in each observed tissue within 24 hoursA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；□：國產(chǎn)制劑；■：進(jìn)口制劑；

2.10 動(dòng)物行為 對(duì)兩組共12只Wistar大鼠分別從尾靜脈注射兩種伏立康唑注射劑后進(jìn)行24 h觀察。(1)0 h：國產(chǎn)制劑組1只大鼠昏厥，進(jìn)口制劑組無大鼠昏厥。(2)12 h：國產(chǎn)制劑組3只大鼠的尾部變黑，毛發(fā)蓬松，縮肩拱背，拒俘反射遲鈍；進(jìn)口制劑組1只大鼠的尾部變黑。(3)24 h：國產(chǎn)制劑組2只大鼠斷尾，4只大鼠尾部變黑，出現(xiàn)燒灼創(chuàng)傷，2只大鼠進(jìn)行攻擊，1只大鼠死亡；進(jìn)口制劑組1只大鼠尾部變黑，出現(xiàn)燒灼創(chuàng)傷，未觀察到大鼠相互攻擊，無死亡。

3 討 論

目前，伏立康唑的劑型有口服制劑和注射劑等，其口服生物利用高，對(duì)曲霉屬、念珠菌屬、足放線病菌屬和鐮刀菌屬的真菌感染有臨床療效，是治療肺霉曲病的首選藥物。伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝[8]，主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血漿中約占72%[9]。

進(jìn)口和國產(chǎn)伏立康唑注射液的溶媒不同，為考察溶媒是否影響伏立康唑注射液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和組織分布，設(shè)計(jì)單周期單劑量尾靜脈注射，考察藥動(dòng)學(xué)和組織分布情況。結(jié)果表明，國產(chǎn)和進(jìn)口伏立康唑注射液的tmax和cmax一致，伏立康唑的平均藥-時(shí)曲線有雙峰現(xiàn)象，符合非線性代謝特點(diǎn)，因靜脈給藥，排除胃對(duì)藥物多時(shí)間和多部位吸收造成雙峰現(xiàn)象的可能性。伏立康唑?yàn)橹苄运幬铮?進(jìn)入血液后，部分藥物分布到內(nèi)臟組織中，當(dāng)代謝到一定程度時(shí)，組織中的藥物重新釋放進(jìn)入血液，可能是造成雙峰現(xiàn)象的主要原因。故此情況下，以t1/2作為主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)不太合理。兩種注射劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著性差異，因此兩種注射劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)表現(xiàn)相似，增溶劑未從本質(zhì)上改變血漿中伏立康唑的藥動(dòng)學(xué)行為。

兩種注射劑在大鼠體內(nèi)的組織分布類似，伏立康唑在肝臟中濃度最高，其余組織中濃度相差不大；伏立康唑氮氧化物在肺、肝臟和心臟中濃度更高，腎臟和腦組織中的濃度更低。伏立康唑的組織藥物濃度-時(shí)間曲線也有雙峰現(xiàn)象，同時(shí)觀察到伏立康唑(進(jìn)口制劑)血藥濃度在12 h內(nèi)的下降速度比國產(chǎn)制劑更快，但國產(chǎn)制劑對(duì)大鼠的刺激性更大，分析原因可能是國產(chǎn)制劑以乙醇-丙二醇=1∶1為溶媒，且采用靜注方式給藥。本研究由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量的限制，只對(duì)單劑量給藥進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的局限性，需要進(jìn)一步深入研究。