曹 翠 宋瑞清,2**

(1. 渭南師范學(xué)院美術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714099； 2. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

0 引 言

云杉八齒小蠧(I.typographus)屬于鞘翅目(Coleoptera)、小蠹蟲科(Scolytidae)、齒小蠹屬(Ips)[1]．主要危害云杉屬、冷杉屬和松屬等植物，猖獗發(fā)生時(shí)可導(dǎo)致樹木成片枯死．小蠹蟲伴生菌是指那些由小蠹蟲攜帶、傳播到寄主植物上，使寄主植物無法正常生長的一種病原真菌[2]．小蠹蟲伴生菌是植物-小蠹蟲-伴生菌系統(tǒng)中削弱樹木抗性、協(xié)助小蠹蟲侵害的重要因子[3]．在小蠹蟲-伴生菌的危害體系中，人們傾向于重視小蠹蟲的防治，而忽視了伴生菌的防治．

通常情況下，在防治害蟲和病原菌的過程中，人們多傾向于使用殺菌劑，而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用在防治植物病蟲害的同時(shí)，也殺死了環(huán)境中的有益微生物，提高了植物病原菌的抗藥性，同時(shí)也嚴(yán)重破壞了農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，造成環(huán)境污染．隨著生物科技的發(fā)展，拮抗真菌在植病生物防治中的應(yīng)用受到研究者的重視，即用生物方式來防治植物病害，在無人工干預(yù)條件下，采用一類或多類生物來減少病原菌數(shù)量或病害發(fā)生和減弱一些致病的病原體的生存活力，旨在減少由病原菌所導(dǎo)致的災(zāi)害．目前已有多種微生物具有生物防治作用，在20世紀(jì)30年代，研究顯示木霉菌對(duì)植物病原菌的拮抗作用[4]．自20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外對(duì)木霉菌的拮抗作用及其機(jī)制作了許多深入研究，證實(shí)了木霉對(duì)病原菌的重寄生現(xiàn)象，同時(shí)在溫室及田間試驗(yàn)中也取得了較好的效果，已經(jīng)有商品化的木霉制劑問世[5]．在防治病害危害植物的前提下應(yīng)該首先保護(hù)植物，文獻(xiàn)中，作者強(qiáng)調(diào)對(duì)植物的保護(hù)，同時(shí)需要維持生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和平衡性，故利用生物防治病蟲害對(duì)植物侵害的道路任重而道遠(yuǎn)[6]．因此，本研究以3株云杉八齒小蠹伴生真菌為拮抗目標(biāo)，通過平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗菌的篩選，選擇對(duì)伴生真菌拮抗效果明顯的拮抗菌，為遭受病害的生物提供功能性的菌株．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究使用的云杉八齒小蠹伴生真菌和拮抗菌株均由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院宋瑞清老師實(shí)驗(yàn)室提供．其中，伴生真菌包括Ophiostomapenicillatum1(OP1)、Ophiostomapenicillatum2(OP2)、Ophiostomasp(OS)．拮抗菌株包括快速生長菌，包括Trichodermacitrinoviride、Trichodermaatroviride、Trichodermaviride和慢速生長菌，包括Alternariatenuissima、Bionectriaochroleuca、Fusariumtricinctum、Gibberellamoniliformis．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行真菌培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組．培養(yǎng)基直徑90 mm，相距45 mm分別接入培養(yǎng)6 d、等量的直徑1 cm菌落．實(shí)驗(yàn)組接入拮抗菌與病原菌菌落，對(duì)照組接入各菌株單獨(dú)培養(yǎng)．菌絲一面向下的菌餅來直接接觸培養(yǎng)基．

按照生長速度，將7株拮抗菌株分為快速生長菌株(3株)和慢速生長菌株(4株)．培養(yǎng)快速生長菌株時(shí)，首先接種伴生菌株，3 d后再接入快速生長菌株；培養(yǎng)慢速生長菌株時(shí)，同時(shí)接種慢速生長菌株和伴生菌株．每組平行3次，培養(yǎng)溫度25℃，每12 h測(cè)量菌落的相對(duì)生長半徑(共4個(gè)半徑)，包括：對(duì)峙培養(yǎng)的病原菌和拮抗菌的相向半徑以及2種真菌各自單獨(dú)培養(yǎng)的半徑[7]．在進(jìn)行拮抗結(jié)果計(jì)算時(shí)，采用兩菌落之間的相向半徑進(jìn)行拮抗生長測(cè)定．

被抑制率的定義是拮抗菌和病原菌被對(duì)方抑制的抑制率，相對(duì)抑制效果的定義為拮抗菌在抑制病原菌時(shí)本身同時(shí)被抑制消耗，自己被抑制一個(gè)單位，即l%時(shí)所得到的抑菌效果[8]．在同一環(huán)境下，真菌群落的各個(gè)成員存在著相互的作用，相對(duì)抑制效果更加顯現(xiàn)拮抗菌的真實(shí)作用，1是相對(duì)抑制效果的閾值．相對(duì)抑菌效果和被抑制率的數(shù)學(xué)定義如下[7]：

式中，d1為單獨(dú)培養(yǎng)菌落半徑;d2為菌落趨生半徑.

相對(duì)抑菌效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率．

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌株單獨(dú)培養(yǎng)菌落直徑

在相同培養(yǎng)基和相同溫度下，不同菌株的生長速度完全不同，菌落直徑數(shù)據(jù)列于表1、2．結(jié)果顯示，2株云杉八齒小蠹伴生真菌OP1和OP2均在24 h 時(shí)菌落已擴(kuò)展，直徑分別為1.15和1.20 cm，伴生真菌OS在24 h后開始生長，在144 h 時(shí)，3株伴生真菌菌落直徑已達(dá)到最大值，分別為8.50、8.43和8.05 cm；4株慢速生長菌(Alternariatenuissima、Bionectriaochroleuca、Fusariumtricinctum和Gibberellamoniliformis)在144 h內(nèi)菌落以不同速度在生長，在144 h時(shí)直徑分別達(dá)到6.70、3.95、7.45和5.65 cm；3株快速生長菌(Trichodermaitrinoviride、Trichodermaviride、Trichodermaatroviride生長速度快，在48 h時(shí)直徑均達(dá)到最大值8.50 cm．

表1 慢速生長菌株單獨(dú)培養(yǎng)菌落直徑/cm

表2 快速生長菌株單獨(dú)培養(yǎng)菌落直徑/cm

2.2 拮抗菌株與OP1菌株拮抗效果

慢生長菌株與OP1菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表3，相關(guān)圖像如圖1所示．在慢速生長菌與伴生真菌的拮抗過程中，伴生真菌的被抑制率總體呈上升趨勢(shì)，至72 或96 h開始相互抑制；在Fusariumtricinctum與OP1的對(duì)峙培養(yǎng)中，72 h后才產(chǎn)生相互之間抑制作用，各自的抑制率隨著時(shí)間的增加被逐漸增大，最大值在144 h(55.29%)處；在Alternariatenuissima與OP1的對(duì)峙培養(yǎng)中，48 h之前Alternariatenuissima對(duì)OP1 的生長有促進(jìn)作用，72 h后出現(xiàn)抑制作用，隨時(shí)間的增加，OP1的抑制率在逐漸增大，144 h達(dá)到最大(51.76%)；在Bionectriaochroleuca與OP1的對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，OP1的生長在72 h之前一直是促進(jìn)狀態(tài)，96 h時(shí)處于抑制狀態(tài)；在Gibberellamoniliformis與OP1的對(duì)峙培養(yǎng)中，OP1的抑制率隨時(shí)間的增加而增大，144 h達(dá)最高(65.88%)．伴生菌株的抑制率明顯高于拮抗菌株的抑制率，特別是Fusariumtricinctum在72 h之前，F(xiàn)usariumtricinctum和OP1處于相互促進(jìn)生長作用(抑制率為負(fù)值)；120 h之前Bionectriaochroleuca的生長基本處于不顯著的促進(jìn)狀態(tài)，之后才逐漸抑制；72 h之前Gibberellamoniliformis生長處于促進(jìn)狀態(tài)，96 h后生長抑制．相對(duì)抑制效果在144 h時(shí)由高至低為：Fusariumtricinctum、Gibberellamoniliformis、Bionectriaochroleuca、Alternariatenuissima，最高值分別達(dá)到34.70、6.77、3.98、2.48．綜上，對(duì)OP1相對(duì)抑制效果相對(duì)好的菌株為Fusariumtricinctum(34.70)．

表3 慢生長菌株與OP1菌株的拮抗數(shù)據(jù)

注： —指無數(shù)據(jù)

圖1 慢生長菌株與OP1菌株的拮抗效果(a)OP1與Fusarium tricinctum對(duì)峙；(b)OP1與Alternaria tenuissima對(duì)峙；(c)OP1與Bionectria ochroleuca對(duì)峙；(d)OP1與Gibberella moniliformis對(duì)峙

快速生長菌株與OP1菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表4，相關(guān)圖像如圖2所示．在快速生長菌Trichodermacitrinoviride、Trichodermaviride和Trichodermaatroviride與OP1的對(duì)峙培養(yǎng)中，12 h之前OP1生長處于促進(jìn)狀態(tài)，與OP1菌落在36 h時(shí)接觸，接觸以后即出現(xiàn)對(duì)峙之勢(shì)，兩菌落停止生長，呈現(xiàn)顯著的抑菌帶．可能原因是，本研究先接入OP1在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，含有充足的營養(yǎng)和具有大量的空間，OP1的抑制率小于快速生長菌．3株生長快速的菌株與OP1之間均出現(xiàn)顯著的抑菌帶，抗生素在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了．在全部對(duì)峙培養(yǎng)中，均沒有超過1，全部在60 h達(dá)到最大(0.29、0.29和0.35)．綜上所述，表明Trichodermaatroviride對(duì)OP1有顯著的抑制效果，其他2個(gè)菌株有較好的抑制作用．

表4 快速生長菌株與OP1菌株的拮抗數(shù)據(jù)

注： —指無數(shù)據(jù)

圖2 快速生長菌株與OP1菌株的拮抗效果(a)OP1與Trichoderma citrinoviride對(duì)峙；(b)OP1與Trichoderma viride對(duì)峙；(c)OP1與Trichoderma atroviride對(duì)峙

2.3 拮抗菌株與OP2菌株的拮抗效果

慢速生長菌株與OP2菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表5，相關(guān)圖像如圖3所示．在慢速生長菌與伴生真菌的拮抗過程中，伴生真菌的抑制率總體呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)usariumtricinctum、Alternariatenuissima和Gibberellamoniliformis與OP2的對(duì)峙培養(yǎng)中，隨著時(shí)間的增加，OP2的抑制率在增大，144 h達(dá)最高，抑制率分別為56.08%、51.34%、53.71%；Bionectriaochroleuca與OP2的對(duì)峙培養(yǎng)中，24 h之前OP2的生長處于促進(jìn)狀態(tài)，48 h后處于抑制狀態(tài)．拮抗菌株的抑制率明顯低于伴生菌株的抑制率，72 h之前伴生真菌OP2對(duì)Fusariumtricinctum的生長有顯著的促進(jìn)作用，96 h后才產(chǎn)生抑制作用；24 h之前OP2對(duì)Alternariatenuissima的生長有促進(jìn)作用，48 h后雙方生長處于相互抑制狀態(tài)；120 h之前Bionectriaochroleuca和Gibberellamoniliformis的生長狀態(tài)一直處于顯著的促進(jìn)狀態(tài)，之后才逐漸抑制．相對(duì)抑制效果在144 h時(shí)由高至低為：Alternariatenuissima、Fusariumtricinctum、Bionectriaochroleuca、Gibberellamoniliformis，最高值分別達(dá)到33.69、14.78、9.77、8.67．因此，對(duì)OP2相對(duì)抑制效果好的菌株為Alternariatenuissima和Fusariumtricinctum．

表5 慢速生長菌株與OP2菌株的拮抗數(shù)據(jù)

注： —指無數(shù)據(jù)

圖3 慢生長菌株與OP2菌株的拮抗效果(a)OP2與Fusarium tricinctum對(duì)峙；(b)OP2與Alternaria tenuissima對(duì)峙；(c)OP2與Bionectria ochroleuca對(duì)峙；(d)OP2與Gibberella moniliformis對(duì)峙

快速生長菌株與OP2菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表6，相關(guān)圖像如圖4所示．在快速生長菌株Trichodermacitrinoviride、Trichodermaviride、和Trichodermaatroviride與OP2的對(duì)峙培養(yǎng)中，12 h后產(chǎn)生抑制作用，Trichodermacitrinoviride與OP2接觸后即呈現(xiàn)對(duì)峙之勢(shì)，2種菌落停止生長，且出現(xiàn)明顯的抑菌帶，Trichodermaviride和Trichodermaatroviride與OP2接觸后，菌落分別繼續(xù)生長侵入OP2的菌落而使OP2菌落減小，也呈現(xiàn)顯著的抑菌帶．被抑制率均隨時(shí)間的增加而增大，60 h達(dá)到最高；OP2首先被接入培養(yǎng)基培養(yǎng)，具有充足的營養(yǎng)和空間，致使OP2的被抑制率小于快速生長菌的．3種生長快速的菌落與OP2的對(duì)峙培養(yǎng)均產(chǎn)生明顯的抑菌帶，表明在短時(shí)間內(nèi)抗生素被產(chǎn)生出來．在全部對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，均沒有超過1，全部在60 h達(dá)到最大,分別是0.30、0.24和0.35．綜上，表明Trichodermaatroviride對(duì)OP2有顯著的抑制效果，其次Trichodermacitrinoviride也有較好的抑制效果．

表6 快速生長菌株與OP2菌株的拮抗數(shù)據(jù)

圖4 快速生長菌株與OP2菌株的拮抗效果(a)OP2與Trichoderma citrinoviride對(duì)峙；(b)OP2與Trichoderma viride對(duì)峙；(c)OP2與Trichoderma atroviride對(duì)峙

2.4 拮抗菌株與OS菌株的拮抗效果

慢速生長菌株與OS菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表7，相關(guān)圖像如圖5所示．在慢速生長菌與伴生真菌的拮抗過程中，伴生真菌的被抑制率總體呈上升趨勢(shì)，至72或96 h開始相互抑制，在Fusariumtricinctum、Alternariatenuissima和Bionectriaochroleuca與OS的對(duì)峙培養(yǎng)中，72 h之前處于相互促進(jìn)中，Alternariatenuissima對(duì)OS的生長有顯著的促進(jìn)作用；在96 h后相互之間才產(chǎn)生抑制作用，隨時(shí)間的增加各自的被抑制率逐漸增大，144 h達(dá)最大(分別為46.58%、45.34%和35.4%)；在Gibberellamoniliformis與OS的對(duì)峙培養(yǎng)中，48 h之前OS的生長處于促進(jìn)狀態(tài)，72 h后產(chǎn)生了抑制作用，被抑制率隨時(shí)間的增加而增大，144 h達(dá)到最高(56.52%)；拮抗菌株的被抑制率明顯低于伴生菌株的被抑制率，在整個(gè)對(duì)峙培養(yǎng)過程中，OS對(duì)Alternariatenuissima和Gibberellamoniliformis的生長一直處于抑制狀態(tài)，隨時(shí)間的延長作用一直增大，144 h被抑制率達(dá)到最高；OS與Bionectriaochroleuca的對(duì)峙培養(yǎng)中，120 h之前Bionectriaochroleuca的生長處于不顯著的促進(jìn)狀態(tài)，之后逐漸抑制．相對(duì)抑制效果在144 h時(shí)由高至低為：Gibberellamoniliformis、Bionectriaochroleuca、Fusariumtricinctum、Alternariatenuissima，最高值分別達(dá)到4.26、3.11、1.48、1.32．因此，對(duì)OS相對(duì)抑制效果好的菌株為Gibberellamoniliformis．

表7 慢速生長菌株與OS菌株的拮抗數(shù)據(jù)

注： —指無數(shù)據(jù)

圖5 慢生長菌株與OS菌株的拮抗效果(a)OS與Fusarium tricinctum對(duì)峙；(b)OS與Alternaria tenuissima對(duì)峙；(c)OS與Bionectria ochroleuca對(duì)峙；(d)OS與Gibberella moniliformis對(duì)峙

快速生長菌株與OS菌株的拮抗數(shù)據(jù)列于表8，相關(guān)圖像如圖6所示．在快速生長菌株Trichodermacitrinoviride、Trichodermaviride和Trichodermaatroviride與OS的對(duì)峙培養(yǎng)中，在快速生長菌接入12 h后與OS菌落接觸，雙方產(chǎn)生抑制作用，接觸后快速生長菌菌落分別繼續(xù)生長侵入OS的菌落而使OS菌落減小．被抑制率均隨時(shí)間的增加而增大，60 h達(dá)到最高；因OS先被接入培養(yǎng)基，具有充足的營養(yǎng)和巨大的空間，致使OS的被抑制率顯著小于快速生長菌．各對(duì)峙培養(yǎng)均產(chǎn)生明顯的抑菌帶，說明抗生素在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生．在全部對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中，在36 h時(shí)，相對(duì)抑制效果大于1，全部在60 h達(dá)到最大(分別是2.00、1.47和1.77)．因此，對(duì)OS相對(duì)抑制效果好的快速生長菌株為Trichodermacitrinoviride和Trichodermaatroviride．

表8 快速生長菌株與OS菌株的拮抗數(shù)據(jù)

圖6 快速生長菌株與OS菌株的拮抗效果(a)OS與Trichoderma citrinoviride對(duì)峙；(b)OS與Trichoderma viride對(duì)峙；(c)OS與Trichoderma atroviride對(duì)峙

3 討 論

在相同的生物環(huán)境中，通過采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[9]，真菌間的相互關(guān)系能夠很好的反映．本研究通過采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，使用相對(duì)抑制率和被抑制率兩個(gè)指標(biāo)來共同評(píng)價(jià)7株拮抗菌株對(duì)3株伴生真菌的拮抗效果，結(jié)果表明，Trichodermaatroviride以其生長較快，能較先搶占營養(yǎng)和生存空間，從而有效抑制了云杉八齒小蠹伴生真菌OP1和OP2的擴(kuò)展，有顯著的抑制效果，Trichodermacitrinoviride對(duì)OS同樣有顯著的抑制效果．慢速生長菌中，篩選出對(duì)OP1抑制效果最佳的菌株為Fusariumtricinctum(34.70)、Gibberellamoniliformis(6.77)；對(duì)OP2抑制效果好的菌株為Alternariatenuissima(33.69)、Fusariumtricinctum(14.78)；對(duì)OS抑制效果好的菌株為Gibberellamoniliformis(4.26)、Bionectriaochroleuca(3.11)；篩選出幾種拮抗菌株均具備作為生物防治資源的潛力．

由于接入時(shí)間的不同而使快、慢生長菌的相對(duì)抑制效果不同．試驗(yàn)結(jié)果顯示，有部分菌株的生長速度之所以減慢，是由于生長速度迅速的菌株抑制了其生長．于是，Shaw等[10]提出緩慢生長的菌株應(yīng)該早于快速生長的菌株放入培養(yǎng)皿．由此，二者就可以在培養(yǎng)皿的中心直徑處相接．從試驗(yàn)中，可以得出快速生長菌與伴生真菌的各對(duì)峙培養(yǎng)均產(chǎn)生明顯的抑菌帶，說明在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了抗生素．快速生長菌在短時(shí)間內(nèi)對(duì)伴生真菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，根據(jù)抑制效果的大小來篩選最佳的拮抗菌株．

在使用傳統(tǒng)反方法篩選拮抗菌時(shí)，是以病原菌和拮抗菌對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)拮抗線的寬窄作為評(píng)價(jià)的準(zhǔn)則．但是在自然界中，顯著拮抗的真菌在同一環(huán)境中很難同時(shí)存在．因此，與室內(nèi)結(jié)果相比，被篩選出的拮抗菌在實(shí)際應(yīng)用環(huán)境中，結(jié)果并不理想．平板對(duì)峙培養(yǎng)可以觀察同一生境中的真菌的互相作用，對(duì)相互間的影響能夠很好的反應(yīng)[9]．本研究所采用的拮抗菌與伴生真菌生活在同一環(huán)境中，在此條件下篩選獲得的拮抗效果顯著的菌種將更適合于實(shí)際的應(yīng)用環(huán)境．