朱 平 李秀玲 王思磊 張秀芹△

（1.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200；2.山東省青島市即墨區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，山東 青島 266200）

盆腔炎為婦科常見生殖道感染性炎癥疾病，常累及子宮、卵巢及輸卵管組織病變，臨床表現(xiàn)為下腹痛、發(fā)熱、腹瀉、性交痛和尿痛等，如治療不及時(shí)可導(dǎo)致慢性盆腔炎、感染性休克、敗血癥等，嚴(yán)重危害身心健康［1-2］。盆腔炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)在發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，可促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（IL-2）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）因子釋放，刺激內(nèi)皮細(xì)胞并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成血液循環(huán)和微循環(huán)發(fā)生障礙，引起血液流變性改變，抑制機(jī)體的免疫功能，急性盆腔炎現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療主要為抗生素治療［3-4］。盆腔炎屬中醫(yī)帶下病、熱入血室、經(jīng)病疼痛、月經(jīng)不調(diào)等婦科雜病范疇，風(fēng)寒濕熱邪毒、蟲毒等侵襲胞宮脈絡(luò)，邪毒熾盛則釀腐釀膿，治宜清熱利濕、活血化瘀［5-6］。盆炎湯為本院治療急性盆腔炎的院內(nèi)協(xié)定方，由丹參、敗醬草、當(dāng)歸等10味中藥組成，具有活血化瘀、清熱利濕功效，對急性盆腔炎具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究選取急性盆腔炎模型大鼠，旨在觀察盆炎湯對細(xì)胞炎癥因子、免疫功能及自由基代謝的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級Wistar雌性大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2017-0001。體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡8～10周。12 h晝夜節(jié)律（23±2）℃環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 藥物與試劑 盆炎湯（丹參20 g，敗醬草20 g，當(dāng)歸10 g，薏苡仁10 g，梔子10 g，金櫻子根10 g，大血藤10 g，續(xù)斷10 g，杜仲10 g，甘草5 g）由藥房提供，藥材加入10倍量水煎煮2 h，過濾，藥渣加入8倍量水，采用HRY1+1煎藥機(jī)（濟(jì)南華瑞原）煎煮1 h，合并濾液，制成每毫升含1、2、3 g原藥材溶液；婦科千金片，0.4 g/片，36片/盒，株洲千金藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號20180623。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乙型溶血性鏈球菌購于北納生物科技有限公司，批號分別為20171203、20180007、20180002；戊巴比妥鈉，購于湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司，批號20170923；多聚甲酸，北京全世金生物科技有限公司，批號20180319；中性樹膠，上海戴洋儀器有限公司，批號20171105；TNF-α、IL-2和IL-6檢測試劑盒，購于北京中同生物技術(shù)有限公司，批號分別為J180007、J170023、J1800012；FITC試劑盒，杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司，批號20180307；MDA、SOD試劑盒，購于武漢華美生物工程有限公司，批號分別為20180304、20171206。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BX60顯微鏡，日本Olympus Optical公司；數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；LDZ-2型低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；RM2125切片機(jī)和TPIIZO全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)，德國徠卡公司；Y6-6LF生物組織包埋機(jī)，湖北亞光易用電子技術(shù)有限公司，ELx800酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；OLYMPUSAU5400全自動(dòng)生化分析儀，日本Olympus Optical公司；FAC Scalibur型流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司。

1.4 模型建立 采用子宮內(nèi)接種混合菌液法制備急性盆腔炎Wistar大鼠模型。3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，將0.2 mL混合菌液（含金黃色葡萄球菌1012/L，大腸桿菌1012/L，乙型溶血性鏈球菌1012/L）磨口針頭于子宮頸分叉處分別進(jìn)入兩側(cè)宮腔，每側(cè)注射0.1 mL，并機(jī)械性損傷子宮內(nèi)膜組織，注射后陰道底部明膠海綿防菌液漏出。空白組操作同上，注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.5 分組及給藥 將50只Wistar備急性盆腔炎模型分機(jī)分為模型組及盆炎湯低、中、高劑量組和對照組，每組10只，另選取10只健康Wistar大鼠作為空白組。造模5 d后，空白組和模型組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，盆炎湯低、中、高劑量組分別給予1、2、3 g/mL的盆炎湯煎液，對照組給予0.63 g/mL的婦科千金片（取2瓶婦科千金片，研碎，加入45 mL 0.9%氯化鈉注射液，超聲溶解），每日9∶00～10∶00，采用12號彎針灌胃器灌胃1次，連續(xù)給藥3周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）連續(xù)給藥3周后，處死各組大鼠，取大鼠左側(cè)子宮組織，0.9%氯化鈉注射液清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。2）心臟取血，3000 g/min離心20 min，取上清，ELISA法檢查血清TNF-α、IL-2、IL-6、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，按照說明書操作。3）取各組大鼠血液至流式管中，分別加入APC-anti-CD4、R-PE-anti-CD25單抗和50μL EDTA抗凝血，混合均勻，室溫避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育20 min，2000 r/min離心10 min，離心半徑為10.5 cm，棄去上清，每管加2 mL PBS混勻，離心棄去上清，重復(fù)洗滌2次，棄上清，加2 mL PBS重懸混勻后，流式分析外周血CD4+、CD8+和NKT細(xì)胞含量。4）全自動(dòng)生化分析儀檢測血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切等血液流變學(xué)指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 各組大鼠子宮組織病理切片（HE染色，200倍）

2.1 各組子宮組織病理形態(tài)學(xué)比較 見圖1?？瞻捉M子宮形態(tài)正常，子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密整齊，肌纖維紋理清晰，宮壁各層分界清楚，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組子宮形態(tài)失常，子宮壁增厚，組織結(jié)構(gòu)紊亂，子宮內(nèi)膜脫落缺失，內(nèi)膜充血水腫，各層分界不清，上皮細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，說明接種混合菌液法制備急性盆腔炎大鼠模型成功。盆炎湯各劑量組和對照組組織結(jié)構(gòu)基本清晰，無明顯炎性滲出，少量炎性細(xì)胞浸潤，說明盆炎湯和婦科千金片均可改善急性盆腔炎大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)病理狀態(tài)。

2.2 各組炎癥因子水平比較 見表1。模型組TNF-α和IL-6水平顯著高于空白組，而IL-2低于空白組，盆炎湯各劑量組和對照組TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組，IL-2水平顯著高于模型組，且盆炎湯中、高劑量組和對照組顯著低于盆炎湯低劑量組（P＜0.05）。但盆炎湯中、高劑量組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-2和IL-6水平比較（ng/L，±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-2和IL-6水平比較（ng/L，±s）

與空白組比較，?P＜0.05，與模型組比較，△P＜0.05，與盆炎湯低劑量組比較，▲P＜0.05。下同

組別空白組模型組盆炎湯低劑量組盆炎湯中劑量組盆炎湯高劑量組對照組n 101010101010 TNF-α 21.31±2.5635.12±3.17*31.35±2.68*△26.17±2.63*△▲25.22±2.71*△▲25.61±2.59*△▲IL-2115.34±4.2383.41±3.69*91.26±4.17*△99.07±3.86*△▲102.01±4.27*△▲101.61±3.79*△▲IL-670.29±3.6790.37±3.54*82.23±4.02*△75.22±3.69*△▲76.04±3.54*△▲74.69±3.75*△▲

2.3 各組免疫功能指標(biāo)比較 見表2。模型組CD8+含量顯著高于空白組，CD4+和NKT細(xì)胞顯著低于空白組，盆炎湯各劑量組和對照組CD8+含量顯著低于模型組，CD8+和NKT細(xì)胞顯著高于模型組（P＜0.05）。但盆炎湯中、高劑量組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠外周血CD4+、CD8+和NKT細(xì)胞含量比較（%，±s）

表2 各組大鼠外周血CD4+、CD8+和NKT細(xì)胞含量比較（%，±s）

組別空白組模型組盆炎湯低劑量組盆炎湯中劑量組盆炎湯高劑量組對照組n 101010101010 CD4+36.31±4.5626.23±4.15*30.04±5.27*△33.56±4.89*△▲34.01±4.36*△▲33.89±4.28*△▲CD8+23.34±3.6136.12±4.51*32.86±5.42*△28.27±5.05*△▲27.63±5.02*△▲28.12±4.63*△▲NKT細(xì)胞7.23±1.214.34±0.97*5.17±1.13*△6.25±1.35*△▲6.79±1.07*△▲6.82±1.05*△▲

2.4 各組自由基代謝指標(biāo)比較 見表3。模型組MDA水平顯著高于空白組，而SOD水平顯著低于模型組，盆炎湯各劑量組和對照組MDA水平低于模型組，而SOD水平高于模型組，且盆炎湯中、高劑量組和對照組顯著低于盆炎湯低劑量組（P＜0.05）。但盆炎湯中、高劑量組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 各組血液流變學(xué)指標(biāo)比較 見表4。模型組血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切明顯高于空白組，盆炎湯各劑量組和對照組血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切顯著低于模型組，盆炎湯中、高劑量組明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清MDA和SOD水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清MDA和SOD水平比較（±s）

組別空白組模型組盆炎湯低劑量組盆炎湯中劑量組盆炎湯高劑量組對照組n 101010101010 MDA（nmol/mL）6.12±0.5318.25±1.63*13.42±1.71*△8.03±1.43*△▲7.91±1.17*△▲8.69±1.57*△▲SOD（U/mL）288.74±16.37127.38±10.38*165.54±12.36*△204.48±15.67*△▲210.06±17.25*△▲198.47±14.96*△▲

表4 各組大鼠血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切比較（mPa·s，±s）

表4 各組大鼠血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切比較（mPa·s，±s）

組別空白組模型組盆炎湯低劑量組盆炎湯中劑量組盆炎湯高劑量組對照組n 101010101010血漿黏度1.17±0.383.41±0.62*2.41±0.53*△1.78±0.49*△▲1.77±0.42*△▲1.85±0.53*△▲全血黏度高切5.18±0.999.64±1.62*7.03±1.14*△5.47±0.89*△▲5.27±0.76*△▲5.67±1.12*△▲全血黏度低切6.12±1.0710.37±0.94*8.68±1.21*△6.87±1.35*△▲6.54±1.12*△▲7.02±0.98*△▲

3 討論

盆腔炎為婦科陰道內(nèi)的菌群紊亂引起的疾病，急性患者如治療不及時(shí)易導(dǎo)致慢性盆腔炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膿毒血癥或敗血癥。盆腔炎經(jīng)生殖系統(tǒng)向上侵襲感染，直接蔓延或經(jīng)血循環(huán)傳播，導(dǎo)致子宮、輸卵管、盆腔腹膜組織病變，炎癥早期以變質(zhì)及滲出為主要病理改變［7］。研究認(rèn)為盆腔炎的發(fā)生多與免疫因素、氧自由基及血液流變學(xué)等因素有關(guān)，過量TNF-α?xí)?dǎo)致劇烈的免疫反應(yīng)，造成子宮組織病理損傷，機(jī)體感染時(shí)IL-2水平降低，IL-2通過減少免疫抗體減輕組織損傷，IL-6為炎癥反應(yīng)的中樞，直接反映損害的嚴(yán)重程度，炎癥因子引起機(jī)體免疫功能下降［8］。氧自由基與機(jī)體損傷密切相關(guān)，盆腔炎患者產(chǎn)生大量氧自由基，既能幫助殺死中性粒細(xì)胞，也可損傷正常組織，SOD含量與盆腔炎發(fā)生發(fā)展有關(guān)［9］。細(xì)胞凋亡限制機(jī)體免疫應(yīng)答，血液黏滯度升高導(dǎo)致血液循環(huán)異常，加重盆腔炎的發(fā)生發(fā)展［10］。西醫(yī)治療主要以抗生素、透明質(zhì)酸酶、手術(shù)等為主，雖可控制病情進(jìn)展，不及時(shí)正規(guī)治療科延誤病情，甚至進(jìn)展為纏綿難愈后遺癥或敗血癥。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為盆腔炎屬于“濕熱蘊(yùn)結(jié)下焦”范疇，是因產(chǎn)后瘀血內(nèi)停，聚集成團(tuán)而痛，“沖脈為病，逆氣里急”，盆腔炎所致的疼痛是由于邪搏氣血而成，致病因素為濕、熱、瘀，熱毒邪乘虛而入，導(dǎo)致腹痛、瘕聚等癥，月經(jīng)異常繼而導(dǎo)致盆腔炎，血?dú)馐д{(diào)、瘀阻胞脈而發(fā)?。?1］。活血化瘀、清熱利濕為治療盆腔炎為其首要治法，旨在促進(jìn)血液的循環(huán)，緩解盆腔炎癥。盆炎湯由丹參、敗醬草、當(dāng)歸、薏苡仁、梔子、金櫻子根、大血藤、續(xù)斷、杜仲、甘草組成，方中丹參和當(dāng)歸行血活血、補(bǔ)而不滯、涼而不寒、去疾生新，丹參為調(diào)理血分之要藥，活血化瘀止痛，當(dāng)歸性溫味甘專能補(bǔ)血；敗醬草清熱解毒、散結(jié)消癰、行血散疾，入下焦而清熱解毒、活血化瘀；薏苡仁清熱祛濕，梔子清熱燥濕、瀉火解毒，濕熱瘀血得之以解，胞宮血脈得安；金櫻子根清熱解毒、疏散風(fēng)熱，大血藤活血通絡(luò)，敗毒散瘀消癰，甘草清熱解毒止痛、調(diào)和藥性之效［12-13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，盆炎湯各劑量組可顯著改善急性盆腔炎大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)病理狀態(tài)，降低TNF-α、IL-6、CD8+、NKT和MDA水平，升高IL-2、CD8+和SOD水平，且升高血漿黏度、全血黏度高切、全血黏度低切等血液流變學(xué)指標(biāo)。其機(jī)制可能與方中大血藤通過抑制炎癥相關(guān)反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有關(guān)［14］。盆炎湯通過活血化瘀、清熱利濕作用，維持血管張力和血小板內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，促使血管壁和血小板相互作用，通過影響炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、清除自由基、提高內(nèi)源性抗氧化劑活性來減少M(fèi)DA水平，增加SOD水平［15］。敗醬草具有較好的抗菌作用，對多種病菌有明顯的抑制作用，提高單核細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬能力，有提高機(jī)體免疫力的作用，丹參可激發(fā)人體器官組織的修復(fù)，能夠抗炎消肺，抑制細(xì)菌生長［16-17］。

綜上所述，盆炎湯對急性盆腔炎模型大鼠具有較好的防治作用，可降低細(xì)胞炎癥因子水平，改善免疫功能、自由基代謝和血液流變學(xué)指標(biāo)。