肖德勇　鄭廣順　林昆哲　魏梁峰　王守森

【摘要】 目的：探討受體相互作用蛋白-3（RIP3）在垂體腺瘤病理組織中是否表達(dá)及其亞細(xì)胞定位，分析RIP3表達(dá)是否與垂體腺瘤卒中囊變、侵襲性等生物學(xué)行為存在相關(guān)，為垂體腺瘤的臨床治療和預(yù)后分析提供新的思路或探索途徑。方法：連續(xù)收集經(jīng)臨床手術(shù)+病理證實的垂體腺瘤128例，按術(shù)前MRI影像分為實質(zhì)性組、囊變無液平面組和囊變伴液平面組，免疫組化技術(shù)檢測RIP3蛋白表達(dá)，結(jié)合臨床和影像資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：RIP3蛋白主要表達(dá)在胞核，胞質(zhì)中表達(dá)量少，呈棕黃色染色。囊變伴液平面組垂體腺瘤陽性表達(dá)率高達(dá)88.9%，均較實質(zhì)性組和囊變無液平面組高（P<0.05）。RIP3陽性表達(dá)率與垂體腺瘤侵襲性無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論：RIP3在垂體腺瘤組織中存在陽性表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞核，陽性表達(dá)可能與垂體腺瘤出血性卒中有關(guān)，可為垂體腺瘤的研究提供新的探索途徑。

【關(guān)鍵詞】 垂體腺瘤; 垂體卒中; 受體相互作用蛋白3; 免疫組化; 病理; MRI

Expression of Receptor Interaction Protein-3 in Pituitary Adenomas/XIAO Deyong，ZHENG Guangshun，LIN Kunzhe，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：00-005

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of receptor interaction protein-3（RIP3）in pituitary adenoma patients pathological tissues and the sub-cellular localization，and to investigate the relationship of the expression of RIP3 and biological behaviors such as cystic changes and invasiveness in pituitary adenomas，providing new ideas or methods for clinical treatment or prognosis analysis for pituitary adenomas.Method：RIP3 expression in 128 continuous cases of the pituitary adenoma pathological tissues was detected by immunohistochemmistry，who were divided into three groups according to the preoperative MRI images：substantive group，cystic without fluid level group and cystic with fluid level group.The expression of RIP3 was statistical analysis combined with clinical and imaging data.Result：There were RIP3 expresses in the PA pathological tissues，which mainly located in nucleus but weekly in cytoplasm，showing brownish yellow staining.The positive expression rate in cystic with fluid level group was as high as 88.9%，which was higher than those of other groups（P<0.05）.The positive expression rate of RIP3 was not associated with the invasiveness of pituitary adenoma（P>0.05）.Conclusion：There is RIP3 expression in pituitary adenoma pathological tissues，which is mainly expressed in the nucleus.The RIP3 expression may be related to hemorrhagic stroke of pituitary adenoma，which may provide a new exploration method for the study of pituitary adenomas.

【Key words】 Pituitary adenoma; Pituitary apoplexy; Receptor interaction protein 3; Immunohistochemistry; Pathology; MRI

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Xiamen Medical College，Xiamen 362100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.001

垂體腺瘤是顱內(nèi)常見的良性腫瘤，約10%呈侵襲性生長，0.6%～9.1%的垂體腺瘤可發(fā)生卒中[1-2]。目前，有關(guān)垂體腺瘤卒中、囊變、侵襲性等生物學(xué)行為的病理機制尚未明確，需要進(jìn)一步尋找更為有效和可靠的分子病理學(xué)指標(biāo)，為臨床診療及預(yù)后評價提供指導(dǎo)?；A(chǔ)研究證實，受體相互作用蛋白-3（receptor-interacting proteins 3，RIP3）基因定位于人染色體14q11.2上，該區(qū)域的染色體損傷與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-4]。RIP3不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞程序性壞死（programmed necrosis）過程中也有極重要的作用，調(diào)控著細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死相互轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。近年來，RIP3在腫瘤研究中逐漸受到關(guān)注，但在垂體腺瘤中尚未見相關(guān)的國內(nèi)研究報道，RIP3的亞細(xì)胞定位目前也尚無定論。垂體腺瘤卒中、囊變是由垂體腺瘤繼發(fā)出血或缺血梗死導(dǎo)致的，也存在程序化壞死的特征。本研究采用市售抗RIP3抗體，免疫組化檢測RIP3在人垂體腺瘤病理組織中是否表達(dá)及亞細(xì)胞定位，分析RIP3表達(dá)是否與垂體腺瘤卒中囊變、侵襲性等存在相關(guān)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月-2017年6月本科收治的垂體腺瘤手術(shù)患者共128例，其中男

62例，女66例;年齡7～76歲，平均（45.56±13.91）歲;微腺瘤2例，大腺瘤74例，巨大腺瘤（直徑≥4.0 cm）52例;侵襲性腺瘤64例，非侵襲性腺瘤64例。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)+免疫組化確診垂體腺瘤;均行經(jīng)鼻蝶入路手術(shù);MRI影像和臨床、病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前有放療史;再次手術(shù)患者。所有研究對象均簽署知情同意書和保密協(xié)議書，該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 MRI檢查評估與血清垂體內(nèi)分泌激素檢測 所有研究對象均采用Siemens 3.0T磁共振機，行垂體MRI平掃+增強掃描。對比劑采用釓噴酸葡胺注射液（Gd-DTPA），劑量為0.2 mmol/kg體重。根據(jù)術(shù)前MRI影像所示，分為：實質(zhì)性垂體腺瘤63例，囊變無液平面垂體腺瘤29例，囊變伴有液平面形成垂體腺瘤36例。所有研究對象的血清垂體內(nèi)分泌激素均由本院檢驗科分別測定，包括TSH、T3、T4、FT3、FT4、LH、FSH、PRL、ACTH、GH、E2、睪酮、皮質(zhì)醇等。

1.3 免疫組化檢查 采用市售兔抗人RIP3多克隆抗體（abcam公司）。二抗：KIT-9901即用型免疫組化試劑盒（鼠/兔）（福州邁新生物有限公司）。DAB顯色劑：濃縮DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。所有石蠟包埋組織做3～4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化，行SP法（鏈霉素親生物素-過氧化物酶法）免疫組化染色。

對照：陽性對照以本院病理科脾組織標(biāo)本進(jìn)行同法染色（外傷性脾切除術(shù)后）和結(jié)合abcam公司提供的陽性圖片，陰性對照以PBS液代替一抗作陰性對照。證實市售抗RIP3抗體的可用性及實驗方法的可靠性，確定實驗結(jié)果可信。

結(jié)果判定，陽性表達(dá)：光鏡下，境界清楚，位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色或棕褐色顆粒。無棕黃色顆粒者為陰性細(xì)胞。所有結(jié)果由兩位不知情的病理科醫(yī)師進(jìn)行判斷，高倍鏡下（×400）隨機選取5個視野，參照Birner等[7]方法進(jìn)行半定量分級，以陽性細(xì)胞率和染色強度的得分之和進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞率<10%記為陰性，不論其染色深淺，計1分，陽性細(xì)胞率11%～50%計2分，51%～80%計3分，>80%計4分。染色強度：呈輕度染色（淡黃色）計1分，中度染色（棕黃色）計2分，深度染色（棕褐色）計3分。上述兩項積分之和為3分者為弱陽性（+），4～5分者為中等陽性（++），6～7分者為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIP3在垂體腺瘤病理組織中的免疫組化及亞細(xì)胞定位結(jié)果 128例研究對象中，93例呈現(xiàn)RIP3的陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為72.7%（93/128）。垂體腺瘤組織中RIP3蛋白主要表達(dá)在胞核，少部分在胞漿有少量表達(dá)，光鏡下呈現(xiàn)棕黃色染色，見圖1。

2.2 RIP3表達(dá)與垂體腺瘤卒中囊變間的關(guān)系 根據(jù)

術(shù)前MRI分類，本組實質(zhì)性垂體腺瘤63例，囊變無液平面垂體腺瘤29例，囊變伴有液平面形成垂體腺瘤36例。囊變伴液平面組垂體腺瘤的陽性表達(dá)率高達(dá)88.9%，均較實質(zhì)性組（69.8%）和囊變無液平面組（58.6%）高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=7.902，P=0.019<0.05），見表1。典型病例1，男性，20歲，術(shù)前MRI示垂體腺瘤，大小約3.0 cm×2.0 cm×2.2 cm，腫瘤卒中囊變，囊腔內(nèi)見一個液平面形成，RIP3蛋白主要表達(dá)在胞核，呈棕黃色染色，強陽性（+++），見圖2。典型病例2，男性，46歲，術(shù)前MRI影像示垂體腺瘤，大小約2.1 cm×3.0 cm×1.5 cm，瘤內(nèi)見散在細(xì)小斑點狀的短T1、短T2信號影，腫瘤侵犯蝶竇，周邊強化，中央?yún)^(qū)無強化，RIP3表達(dá)呈陰性（-），見圖3。

2.3 RIP3表達(dá)與垂體腺瘤侵襲性之間的關(guān)系 本組侵襲性腺瘤64例，非侵襲性腺瘤64例。侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤的RIP3蛋白陽性率分別為76.6%（49/64）和68.8%（44/64），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（字2=0.983，P=0.321>0.05），見表2。

3 討論

3.1 RIP3在垂體腺瘤研究中的意義 目前認(rèn)為，機體存在三種死亡方式，即細(xì)胞凋亡（apoptosis）、細(xì)胞自嗜（fautophagy）和細(xì)胞壞死（necrosis）。近年越來越多的研究證據(jù)表明，在一定條件下細(xì)胞壞死也可以被調(diào)控—壞死性凋亡或程序化壞死（necroptosis），它是一種caspase非依賴性細(xì)胞死亡方式。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）被認(rèn)為參與誘導(dǎo)細(xì)胞的程序化壞死，而RIP3則是調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死的關(guān)鍵調(diào)控蛋白—“驅(qū)動閥（trigger）”或“分子開關(guān)”[8-9]。這一發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是為臨床治療腦缺氧、心缺血、動脈粥樣硬化等與細(xì)胞壞死相關(guān)疾病的防治提供了新的思路。假如有效抑制RIP3的活性，就能在一定程度上抑制細(xì)胞壞死，對那些由細(xì)胞壞死導(dǎo)致的疾病就能起到治療、防御或緩解的效果。

垂體腺瘤卒中、囊變是由出血或缺血梗死導(dǎo)致的，也存在著細(xì)胞缺血、缺氧、壞死。垂體腺瘤出血、囊變及其引起的生物學(xué)行為變化，很可能也與TNF-α和RIP3介導(dǎo)的垂體細(xì)胞損傷或壞死有關(guān)。而囊變伴液平面征象被認(rèn)為是垂體腺瘤出血性卒中的特有表現(xiàn)[10]。本組128例垂體腺瘤的研究結(jié)果顯示，RIP3在垂體腺瘤中存在陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為72.7%，囊性伴液平面的垂體腺瘤中表達(dá)量高達(dá)88.9%，比實質(zhì)性垂體腺瘤高，而RIP3的陽性表達(dá)與垂體腺瘤是否具有侵襲性未發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)系，這是首次將RIP3應(yīng)用在垂體腺瘤中的研究。目前國際上關(guān)于RIP3的研究尚處于起步階段，它的許多功能以及它所參與的通路仍不清楚，RIP3如何實現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞凋亡與壞死轉(zhuǎn)換的問題仍有待進(jìn)一步的探索。

本研究結(jié)果顯示，囊變伴液平面組RIP3蛋白陽性率明顯較高，這表明RIP3蛋白可能在垂體腺瘤出血性卒中的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用，腫瘤細(xì)胞中RIP3表達(dá)增加，進(jìn)而啟動腫瘤細(xì)胞的壞死凋亡。Fortes等[11]也認(rèn)為，出血性損傷引起的細(xì)胞死亡表現(xiàn)出程序化壞死的特征，游離的亞鐵血紅素有促炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒作用，其細(xì)胞毒作用造成細(xì)胞膜破壞和氧化應(yīng)激反應(yīng)，TNF-α和RIP蛋白可能在這種亞鐵血紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序化壞死中發(fā)揮重要作用。

3.2 RIP3的研究概況 RIP3是RIP絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，擁有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，具有自磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活NF-kB的作用。過量表達(dá)RIP3基因可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是最早關(guān)于RIP3的生物學(xué)功能報道[12-13]。

而近年的研究認(rèn)為，RIP3蛋白是TNF-α誘導(dǎo)下細(xì)胞發(fā)生凋亡還是壞死的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在非caspase酶依賴性的細(xì)胞壞死中發(fā)揮重要作用[14-16]。

它是細(xì)胞重要的應(yīng)激傳感分子，能根據(jù)不同應(yīng)激信號，啟動和調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，決定細(xì)胞走向凋亡、壞死或存活等不同生存發(fā)展方向，也就是能感受細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的死亡或存活[17-21]。

RNA印跡分析顯示，RIP3廣泛表達(dá)于人的心臟、腦、胎盤、骨骼肌、腎、胰腺、脾、外周血淋巴細(xì)胞、前列腺、結(jié)腸等組織中。染色體研究顯示，rip 基因定位于人類染色體14q11.2，小鼠染色體14B1。但其亞細(xì)胞定位，目前研究尚無統(tǒng)一的定論，免疫熒光分析顯示，外源轉(zhuǎn)染表達(dá)的RIP3蛋白以點狀形態(tài)定位于線粒體。在HeLa細(xì)胞中外源表達(dá)的RIP3定位于細(xì)胞質(zhì)，而突變分析顯示RIP3蛋白可在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中穿梭，是一種細(xì)胞核質(zhì)穿梭蛋白[22]。

3.3 RIP3在垂體腺瘤組織中的表達(dá)及亞細(xì)胞定

位 本組128例垂體腺瘤的免疫組化研究結(jié)果證實，在人垂體腺瘤病理組織中存在RIP3蛋白的表達(dá)，并且進(jìn)一步提示RIP3蛋白的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，且主要表達(dá)于細(xì)胞核，與其相比，在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)明顯較弱。這一研究結(jié)果對RIP3的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并且存在核質(zhì)穿梭現(xiàn)象提供了證據(jù)，研究結(jié)果與Yang等[23]的報道基本吻合?，F(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)提示，RIP3蛋白的亞細(xì)胞定位可能與細(xì)胞的不同生理病理過程有關(guān)，并隨著定位的改變RIP3蛋白可能發(fā)揮不同的作用。

本研究結(jié)果提示，RIP3蛋白表達(dá)與垂體腺瘤侵襲之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)。分析原因，可能與下列因素有關(guān)：（1）本研究采用的病理組織蠟塊，標(biāo)本的采集、保存等過程中可造成結(jié)果影響;

（2）采用新鮮標(biāo)本組織，RT-PCR或Weston blot等檢測手段，結(jié)果可能更精確。本研究是國內(nèi)首次將RIP3應(yīng)用于垂體腺瘤的研究，其與垂體腺瘤的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為關(guān)系等的意義還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗結(jié)果證實在垂體腺瘤病理組織中存在RIP3蛋白的陽性表達(dá)，RIP3主要表達(dá)在細(xì)胞核。囊變伴液平面組垂體腺瘤的RIP3陽性表達(dá)率高于實質(zhì)性垂體腺瘤，提示RIP3蛋白陽性表達(dá)程度可能與垂體腺瘤出血性卒中有關(guān)。進(jìn)一步開展RIP3在垂體腺瘤中的相關(guān)研究，有望為研究垂體腺瘤的生物學(xué)行為提供新的探索途徑，為垂體腺瘤的臨床診療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Ricciuti R，Nocchi N，Arnaldi G，et al.Pituitary Adenoma Apoplexy：Review of Personal Series [J].Asian J Neurosurg，2018，13（3）：560-564.

[2] Capatina C，Inder W，Karavitaki N，et al.Management of endocrine disease：pituitary tumour apoplexy[J].Eur J Endocrinol，2015，172（5）：R179-90.

[3]刁卓，劉曉超，唐玉虎，等.RIP3及TNF-α在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（14）：2283-2287.

[4]任建鴻，鄭文，謝彥，等.RIP3在淋巴瘤患者病理組織中的表達(dá)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11（17）：3275-3279，3289.

[5] Yang X S，Yi T L，Zhang S，et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha is involved in RIP-induced necroptosis caused by in vitro and in vivo ischemic brain injury[J].Sci Rep，2017，7（1）：5818.

[6] Witt A，Vucic D.Diverse ubiquitin linkages regulate RIP kinases-mediated inflammatory and cell death signaling[J].Cell Death Differ，2017，24（7）：1160-1171.

[7] Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cancer[J].Cancer Res，2000，60（17）：4693-4696.

[8] Fulda S.Repurposing anticancer drugs for targeting necroptosis[J].Cell Cycle，2018，17（7）：829-832.

[9] Vandenabeele P，Declercq W，Van Herreweghe F，et al.The role of the kinases RIP1 and RIP3 in TNF-induced necrosis[J].Sci Signal，2010，3（115）：re4.

[10]王守森，肖德勇.垂體腺瘤卒中：問題與爭議[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2017，16（2）：109-113.

[11] Fortes G B，Alves L S，de Oliveira R，et al.Heme induces programmed necrosis on macrophages through autocrine TNF and ROS production[J].Blood，2012，119（10）：2368-2375.

[12]謝田田，劉婷婷，芮濤.受體相互作用蛋白3在心血管疾病中的新進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2018，39（5）：859-862.

[13] Witt A，Vucic D，Diverse ubiquitin linkages regulate RIP kinases-mediated inflammatory and cell death signaling[J].Cell Death Differ，2017，24（7）：1160-1171.

[14] Moquin D M，McQuade T，Chan F K.CYLD deubiquitinates RIP1 in the TNFalpha-induced necrosome to facilitate kinase activation and programmed necrosis[J].PLoS One，2013，8（10）：e76841.

[15] Liu X，Shi F，Li Y，et al.Post-translational modifications as key regulators of TNF-induced necroptosis[J].Cell Death Dis，2016，7（7）：e2293.

[16] Sosna J，Voigt S，Mathieu S，et al.TNF-induced necroptosis and PARP-1-mediated necrosis represent distinct routes to programmed necrotic cell death[J].Cell Mol Life Sci，2014，71（2）：331-348.

[17] Shlomovitz I，Zargrian S，Gerlic M.Mechanisms of RIPK3-induced inflammation[J].Immunol Cell Biol，2017，95（2）：166-172.

[18] Moriwaki K，Chan F K.RIP3：a molecular switch for necrosis and inflammation[J].Genes Dev，2013，27（15）：1640-1649.

[19] Dong Y，Bao C，Yu J，et al.Receptor-interacting protein kinase 3-mediated programmed cell necrosis in rats subjected to focal cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Mol Med Rep，2016，14（1）：728-736.

[20] Declercq W，Vanden B T，Vandenabeele P.RIP kinases at the crossroads of cell death and survival[J].Cell，2009，138（2）：229-232.

[21] Das A，McDonald D G，Dixon-Mah Y N，et al.RIP1 and RIP3 complex regulates radiation-induced programmed necrosis in glioblastoma[J].Tumour Biol，2016，37（6）：7525-7534.

[22] Zhang D W，Shao J，Lin J，et al.RIP3，an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis[J].Science，2009，325（5938）：332-336.

[23] Yang Y，Ma J，Chen Y，et al.Nucleocytoplasmic shuttling of receptor interacting protein 3（RIP3）：identification of novel nuclear export and import signals in RIP3[J].J Biol Chem，2004，279（37）：38820-38829.